张锋公司新文章：如何提高CRISPR基因组编辑的特异性

　　2016年08月22日讯 CRISPR是规律成簇的间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）的缩写。CRISPR与内切酶Cas9是一对好基友，细菌依靠它们组成的防御系统对抗外来侵略者。CRISPR-Cas9能够在引导RNA的指引下，靶标并切割入侵者的遗传物质。2012年研究者们利用这一特点，将CRISPR系统发展成了强大的基因组编辑工具。该系统使用简单而且扩展性强，很快便成为了生物学领域最耀眼的明星。

　　在过去的四年中，CRISPR-Cas9经历了不断的更新换代。这一技术让基因功能研究达到了前所未有的精确性和灵敏度。CRISPR-Cas9在医疗领域也展现了极大的潜力，有望通过直接校正致病突变治疗遗传疾病。不过，我们都知道Cas9会在脱靶位点结合和切割DNA。

　　CRISPR脱靶效应常被人们挂在嘴边，这也是该技术最大的隐患之一。Cas9酶有时会在靶点以外的地方进行切割，而这种切割有可能引起癌症。好在，研究者们在提升CRISPR特异性的时候动作很快。

　　Editas Medicine公司的研究团队在本期Molecular Cell杂志上发表文章，回顾了Cas9特异性研究近年来取得的突破。这篇文章着重介绍了提高Cas9特异性的关键工具和策略，为从事基因组编辑的研究者们提供了一份综合性的实用手册。文章指出，研究者们现在应当努力使这样的方法标准化，同时进一步改善CRISPR-Cas9的特异性。Editas Medicine公司是CRISPR技术先驱张锋等人创立的，致力于通过基因编辑治疗人类疾病。

　　张锋是麻省理工学院脑与认知科学助理教授、McGovern 脑研究所和Broad研究所核心成员，著名CRISPR技术先驱。曾荣获美国生物医学大奖：瓦利基金青年研究家奖。去年年底，张锋的研究团队对化脓链球菌的Cas9进行了3个氨基酸的改造，建立了革命性的CRISPR-Cas9基因编辑系统，大大减少了“脱靶”编辑错误。这一完善的技术解决了使用基因组编辑时面对的一个主要技术问题。

　　今年一月，韩国首尔大学的研究人员在Genome Research杂志上发表文章，为人们展示了升级版的多重化Digenome-seq。他们用这一技术同时分析了11个CRISPR-Cas9核酸酶在整个基因组中的特异性，大大节省了CRISPR脱靶分析所需的时间和经费。研究证实，多重化Digenome-seq可以捕捉到很多被其他方法漏掉的良性脱靶位点。研究人员还在此基础上给出了减少CRISPR-Cas9脱靶效应的指南。

　　加州大学伯克利分校的研究人员对CRISPR-Cas9技术做出了重大改进。在用一段短DNA片段替代另一段DNA时，他们的方法获得了高达60%的成功率，这么高的成功率是前所未有的。研究人员在1月21日的《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上描述了他们的这项新技术。（更多详细信息参见：Nature Biotechnology：实现前所未有的CRISPR基因编辑成功率）麻省总医院的研究人员也在Nature杂志上发布了改良版CRISPR技术。他们通过改造Cas9酶大大减少了它与DNA的非特异性互作，将脱靶效率降低至无法检测到的水平。

　　CRISPR-Cpf1能够在crRNA的引导下在人类细胞中剪切目标DNA，被称为是新一代的CRISPR基因组编辑系统。不过，人们对这个系统的作用机制还知之甚少。麻省总医院、哈佛医学院的研究人员解析了Cpf1核酸酶在人类细胞中的全基因组特异性，并将研究结果发布在6月27日的《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上。

　　Broad研究所遗传干扰平台（GPP）和微软研究所的研究人员开发了一种预测模型。这种模型可以为人们揭示哪些单导向RNA （sgRNA）序列能够与CRISPR-Cas9形成最佳组合，更有效地探查基因组秘密。这一研究小组将他们的方法报告在了本周的《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上，并准备通过Addgene公司向科研团体提供针对人类和小鼠基因组的sgRNAs优选清单。

　　CRISPR先驱Jennifer A Doudna领导研究团队揭示了CRISPR-Cas9剪切DNA时的关键分子结构。在CRISPR-Cas系统中，Cas蛋白与小CRISPR RNA（crRNA）形成复合体，切割与RNA互补的外源DNA。R-loop是I型和 II型CRISPR-Cas的一个典型特征，基因组编辑常用的sgRNA就会和Cas9形成R-loop。为了阐明R-loop的作用，研究人员通过冷冻电镜获得了酿脓链球菌Cas9 R-loop的高分辨率结构。