单细胞技术让这些研究成为现实

2016-11-01 21:23 来源:网友分享

  2016年10月18日讯 如今,细胞群体的平均值数据已不再能够满足研究的需求。研究人员开始转向单细胞来探索基本的生物学。在这一期的《BioTechniques》上,Jeffrey Perkel博士介绍了让单细胞实验成为现实的技术。

  2015年底,巴西卫生部门和世界卫生组织报告,新生儿中小头症的发病率急剧增加。没过多久,人们就确定了罪魁祸首:寨卡病毒(Zika)。为何这种病毒在成人中的表现是如何温和,但在新生儿中却造成灾难性的神经畸形。单细胞生物学将告诉我们答案。

  走进寨卡病毒

  加州大学旧金山分校的Arnold Kriegstein获得了奥巴马政府的BRAIN计划资助,希望能分类人脑中的不同细胞。在发育的大脑中研究基因表达,这不是一个新概念,许多研究团队已经做过,但是在大块组织水平。这些研究鉴定出不同区域和不同发育阶段的基因表达差异。不过,他们不能提供细胞特异性指纹。

  为了创建基因表达的指纹,Kriegstein的团队与Fluidigm公司合作,利用自动化的微流体平台 - C1单细胞自动制备系统。C1能够平行捕获800个单细胞,然后分离、逆转录并扩增,输出单细胞cDNA。将这种工具应用在大脑组织上,研究人员之后在Illumina的测序仪上进行测序,并利用分层聚类工具来分类,每一类代表一种特定的细胞类型。在最初的演示中,他们收集了600多个细胞的表达谱,并将它们分成四大类。

  这些数据对于解析寨卡病毒的发病机理特别有用。其他研究人员则在研究病毒的受体。一名博士后研究人员Alex Pollen注意到,一种潜在的寨卡受体AXL,在放射状胶质细胞中高度富集。“如果你试图产生小头症,这些正是你想要瞄准的细胞,”Kriegstein表示。其他细胞也表达AXL,包括神经免疫细胞、内皮细胞和眼睛中的某些细胞,但是神经元大多缺乏AXL表达。“你必须逐个细胞地观察基因表达模式,”他说。“幸运的是,我们一直这么做。”

  发现非整倍体

  其他的研究团队在探索单细胞时,也发现了独到的生物学见解。事实上,单细胞研究的文章数量在急剧增加,从2010年的46篇增长到2015年的332篇。过去的研究仅限于细胞解剖和生理学,但如今研究人员拥有新一代测序仪和质谱仪,能够拷问单个细胞的分子内容。

  然而,这并不是一件简单的事。单细胞中没有足够的DNA或RNA用于直接测序,因此这些大分子首先必须被扩增,这不可避免地让人担心扩增偏倚。蛋白质组学和代谢组学研究并没有这种选择,因此研究必然会推动仪器发展。当然,在分析单个细胞时,区分真正信号和随机噪声也是相当复杂的。

  弗吉尼亚大学医学院的助理教授Michael McConnell正利用单细胞技术来研究大脑中的遗传变异。十五年前,他及同事利用荧光显微镜和染色体绘画技术,发现哺乳动物大脑中的细胞在基因组水平上并不完全相同。大约三分之一的分裂细胞要么缺失大量的遗传物质,要么过量,产生遗传镶嵌。

  如今,McConnell与Salk研究所的Fred Gage合作对110个单细胞进行测序和SNP分析,以便深入研究“体细胞嵌合”的现象。他们发现,大脑中13-41%的细胞含有Mb大小的拷贝数变异,这些重复和缺失小于十五年前描述的非整倍体,但仍有可能影响细胞表型。“这可能改变离子通道组成,进而直接影响生理学,”他说。

  长翼的小鼠?

  宾夕法尼亚大学Perelman医学院的James Eberwine是现代单细胞生物学的先驱之一。自八十年代后期以来,他一直在开发和改进在细胞水平上分析基因表达的方法。据Eberwine介绍,单细胞方法提供的信息无疑会被群体水平的信息所掩盖。他的实验室已利用这种技术来记录细胞之间的mRNA丰度差异,捕获神经树突中的RNA,这个区域曾被认为缺乏转录本。

  不过他也强调,这项技术必须谨慎使用。“我想让人们知道的是,现在开展单细胞分析是相对简单的,但想要做好,并不简单。”数据解释和对照是关键。

  Rusty Lansford也同意这一点,他是南加州大学和洛杉矶儿童医院的副教授。与Eberwine合作,Lansford最近转向单细胞组学,将这些技术与脊椎动物胚胎发育的活细胞成像相结合。他的研究对象是日本鹌鹑。对于这类研究而言,鹌鹑是比小鼠和鸡更好的选择。Lansford称之为“长翼的小鼠”。

  Lansford的实验室一直在开发鹌鹑发育过程中细胞运动的成像方法。他在一个胚胎所有细胞中利用组成型启动子表达红色荧光蛋白,而另一个胚胎利用内皮细胞特异的启动子表达黄色荧光蛋白,之后将动物杂交。Lansford利用共聚焦或双光子显微镜来观察发育中的胚胎,看看每个细胞去哪里。

  在发育一段时间后,他们切下特异细胞,利用免疫组化鉴定细胞类型,然后测序RNA。尽管数据还没有发表,但是研究人员利用这种策略来标记原始生殖细胞,发现他们能够观察到每个细胞发育过程中的转录组变化。这些实验颇有挑战性,不过数据分析要困难得多。“我们必须查看某些事件,了解细胞事件的随机性,”Lansford说。

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