刘卫军：癌症生物学的那些事

　　2016年09月15日讯 这只鸡来自于美国纽约长岛一个农场，是一只在美国普通得不能再普通的鸡，看上去很像中国的芦花鸡。当然，这只对癌症生物学有着重要意义的鸡长了一个肿瘤。这个肿瘤在病理学上被称为肉瘤（sarcoma）。

　　1909年九月的某天，这只鸡被它的主人带到了纽约城内的洛克菲勒大学医学研究所。鸡主人的目的不是向科学家们提供什么研究对象，而是希望有人可以将肿瘤切除，鸡能活下去。1909年10月1日，Francis Peyton Rous做了洛克菲勒大学第一例鸡肿瘤切除手术，满足了鸡主人的心愿，尽管这只鸡不久还是死于肿瘤复发。Rous并没有将切下来的肿瘤仍掉，而是将肿瘤切成小块，然后用套管针将一小块肿瘤接种到健康鸡身上。不久，肿瘤长大了。如此重复，他发现这种肿瘤可以不停地在鸡身上传下去，而且肿瘤生长速度越来越快，并且开始出现转移。

　　随后，Rous用这些肿瘤做了一个经典的实验。这个实验揭开了我们真正开始了解癌症生物学的序幕，也让他在55年后获得了诺贝尔生理和医学奖。Rous将肿瘤组织磨成匀浆，用各种方法去除细胞和可能存在的细菌，制备成无细胞的滤过液。然后，他将滤过液接种于健康鸡上，同样长出了肿瘤。由于只有病毒才有可能存在于这样的无细胞滤过液中，所以这种在鸡身上生长的肿瘤的罪魁祸首就是病毒。这个病毒从此被命名为Rous Sarcoma Virus （RSV）。

　　今天很多人还在做类似的实验，一种被称为病毒感染的实验。只不过我们现在是有目的地利用病毒感染细胞的特性，将我们感兴趣的基因转入细胞内，而不是制造癌细胞。Rous的实验令人信服地证实了病毒感染确实能诱发肿瘤，但除此之外也没有什么让当时的科学界心潮澎湃的，毕竟RSV不是人类癌症的元凶。Rous实验的重要性长期以来也不为大家理解，因为还没有到能够理解的时候。

　　关于人类癌症的起源或者癌症到底是怎么发生的，长期以来有三派观点在争论不休。

　　第一个观点就是Rous长期坚持的，认为癌症和其他什么感冒啊，狂犬病啊，脊髓灰质炎啊以及各种各样的感染性炎症一样，是外来的病原体导致的。这一观点有很多实验支持，在当时颇为流行。1926年的诺贝尔生理和医学奖就给了丹麦科学家Johannes Fibiger，理由是他发现了一种可以导致大鼠胃癌的寄生虫。当然，这是诺贝尔奖委员会经常犯错的一个例子。

　　第二个观点是流行病学家们得出的，癌症是外界环境中物理或化学因素诱变造成的。吸烟能显着升高肺癌的发病率，扫烟囱的孩子容易得阴囊癌，美国制表工厂的Radium Girls多数患有各种各样的癌症和其他疾病，类似的例子不胜枚举。这一观点也有实验支持，日本的山极胜三郎在兔子耳朵上连续不断地涂了至少四个月的煤焦油（三郎也很“二”），终于在1915年他发表论文宣称在显微镜下发现了癌细胞。

　　第三个观点则认为肿瘤起源于细胞本身，Rudolf Virchow（山极胜三郎的老师）在1863年就描述了癌细胞的一些特征；Theodor Boveri在1914年提出癌变可能是染色体突变引发的。这一观点基本上是根据现象作出的合理推测，还没有肯定的实验支持，因此长期处于边缘，没有太多人关注。

　　真正的科学理论其实都是在争论中产生的，因为这符合科学研究是一个盲人摸象的过程的规律。这些争论还要持续半个世纪左右。在这半个世纪里，人类对生命本质的认识在不断进步。

　　首先是摩尔根继承和发展了孟德尔的遗传理论，确立了染色体是基因的载体。

　　1944年Oswald Avery证实遗传物质是DNA。

　　1953年Watson和Crick建立了DNA双螺旋结构模型。1957年Crick进一步提出了遗传信息传递的中心法则。

　　1961年遗传密码被破译。

　　在这一时期，尽管越来越多的病毒被发现可导致动物癌变，对癌症生物学的认识并没有什么重要进展。可以值得一提的有两项发现：雄激素刺激前列腺癌细胞生长（Charles Huggins， 1944）和费城染色体的发现（Peter Nowell和David Hungerford，1959）。但是，以细胞毒药物为代表的化疗药物已经开始在临床使用，并取得一定的疗效。如Goodman和Gilman用氮芥治疗非霍奇金氏淋巴瘤，Farber用叶酸拮抗剂治疗儿童急性白血病，李敏求用叶酸拮抗剂甲氨蝶呤治疗绒膜癌等都在某种程度上取得了成功。

　　理解Rous实验的重要性的时候快要来临了。

　　1951年，Howard M. Temin来到加州理工学院研究果蝇遗传学。但不久他就厌倦了果蝇，转到Renato Dulbecco实验室研究RSV。Temin意识到要真正了解RSV是如何将正常细胞转化为癌细胞，他需要一个简单易行而且快速的模型。类似连续不断地在兔子耳朵上涂几个月煤焦油或者在鸡和老鼠上制造肿瘤模型都不是他所需要的，他需要一个既能定性又能定量研究RSV致癌效应的细胞模型。在加入Dulbecco实验室后的第七年，他和Harry Rubin一起成功地建立了一个称为foci assay的方法。RSV病毒可以使培养的鸡胚细胞癌变不断增殖从而形成foci，正常细胞由于接触抑制会停止生长，不会形成foci。一个RSV病毒颗粒足以完成细胞癌变的转化。

　　Temin和Rubin很快注意到了RSV的独特之处。和其他病毒感染宿主细胞后完成自我复制导致细胞裂解再感染其他细胞不同，RSV在诱发细胞癌变的同时似乎就和它的宿主细胞融为一体了。换句话说，RSV将自己的基因融入了宿主细胞的基因组中。

　　此时RSV已被Crawford等证实为一个RNA病毒。Temin纳闷RSV的RNA是怎么变成DNA融入宿主细胞基因组的。因为根据当时的中心法则从DNA到RNA再翻译成蛋白质的说法，RNA是不会反向生成DNA的。Temin坚信，如果实验数据和教条或者理论有悖，那么教条或理论就到了需要修改的时候了。

　　Temin前瞻性地断定有一种酶可以以RNA为模板生成DNA，他称这种酶为逆转录酶。为了寻找这种酶，他花了十年时间。1970年，一个叫水谷哲的日本人在Temin实验室里终于成功完成了证实逆转录酶存在于RSV的实验。1975年，Temin因为发现逆转录酶分享了诺贝尔生理和医学奖。

　　逆转录酶的发现修改和完善了中心法则，但仍旧不是人类癌症起源的答案，除非能证实逆转录病毒确实也能诱导人类癌症的产生。Sol Spiegelman相信以DNA形式整合到宿主基因组的病毒能以某种方式被重新合成为RNA，然后形成病毒颗粒感染细胞促使癌变产生。这是一个非常符合逻辑的假说。Spiegelman坚信这个假说是成立的，他认为如果逆转录病毒可以引起动物癌症，那么没有理由相信它不会诱发人类癌症。

　　只要在人肿瘤细胞中找到逆转录病毒，就能证实这个假说。

　　Spiegelman应该是那个时代最适合做这个工作的人。早在研究噬菌体MS2的时候，Spiegelman就意识到逆转录酶可能存在，但他没有在MS2中找到这样的酶，却发现了以RNA为模板的RNA聚合酶（RNA replicase）。他在另一个噬菌体Qβ中发现的RNA聚合酶被称为Spiegelman Monster。利用这个酶，Spiegelman第一次在试管内实现了病毒RNA的自我合成，更关键的是这些自我合成的病毒RNA具有感染活性。他还建立和优化了RNA--DNA杂交技术，这一技术不仅使基因定位成为可能，还为DNA重组技术奠定了基础。

　　Spiegelman利用他的RNA--DNA杂交技术在人肿瘤细胞中开始狂热地寻找逆转录病毒，他在很多肿瘤中都发现了一些逆转录病毒的蛛丝马迹，但最终结论是这些肿瘤中并不存在逆转录病毒。

　　在Spiegelman死于胰腺癌的第二年，他的核酸杂交技术在人类另外一种疾病中找到了逆转录病毒，这种疾病被称为艾滋病。七十年代后期，同样是利用核酸杂交技术，Varmus和Bishop在正常细胞中发现了与RSV 癌基因Src的同源基因，创立了原癌基因理论并因此在1989年获得诺贝尔生理和医学奖。

　　回顾这段历史，我们认识到Spiegelman的工作是在错误的地方寻找错误的目标。毕竟其他科学家用同样的方法在肿瘤细胞里发现了原癌基因，在艾滋病中找到了逆转录病毒。用Temin的话说，Spiegelman混淆了信使（逆转录病毒）和信息（癌基因和原癌基因）在肿瘤发生中的作用，这是他方向错误的根本原因。

　　癌基因和原癌基因的发现几乎彻底平息了长达半个多世纪关于癌症起源的争论，并且将三种观点完美地统一起来。无论是病毒感染还是物理化学因素的刺激，都是通过诱导基因突变将原癌基因激活为癌基因，或者将抑癌基因失活，从而最终引发癌症的发生。

　　我们现在可以大致描绘RSV成为一个致癌病毒的过程：RSV在某一时刻偶遇了一个携带Src突变的癌细胞，并将此突变基因纳入麾下，成为RSV的第四个基因。这第四个基因不仅促成了细胞的永生，或许也是RSV在进化过程中长期存在的原因。而正因为RSV仅含有四个基因，使得发现这第四个对癌症生物学至关重要的癌基因相对容易。这个功能强大而构成相对简单的RNA病毒送给研究它的科学家三个诺贝尔生理和医学奖。

　　中国的先哲老子说：“天欲其亡，必令其狂。” 这句话在西方古希腊人那里的版本是：“上帝欲使人灭亡，必先使其疯狂。”

　　癌症正是以这种方式致人于死地的：让细胞疯狂的增殖，不论空间和时间，直至最后死亡。

　　在Src基因被发现后，根据当时流行的“一个基因一个酶（蛋白）”的观点，很多科学家开始着手寻找和鉴定Src基因编码的蛋白产物。蛋白是基因功能的执行者，只有手里有了这个蛋白，才有可能研究Src是怎样让一个正常细胞失去理智而疯狂增殖的。

　　科学家起初试图用体外翻译体系来得到Src基因的蛋白产物。然而，当时DNA重组和基因克隆技术还处于萌芽状态，Src基因并没有被克隆出来，更不用说它的碱基顺序了，大家只是根据Peter Duesberg的实验知道Src基因位于RSV基因组的3‘端。因此，通过这个方法来发现和鉴定Src的蛋白产物非常困难，幸运点的如Tony Hunter也只是拿到了Src蛋白的部分片段，功能研究更无从谈起。

　　Ray Erikson决定用免疫沉淀的方法将Src蛋白钓出来。如果把细胞比作一个大湖，细胞里面的各种蛋白就是湖里种类繁多的鱼。要钓到你想要的鱼，你得准备特殊的鱼饵。这个鱼饵在免疫沉淀里就是抗体，抗体越特异越灵敏，成功的机会就越大。Erikson和他的博士后Joan Brugge 花了近三年时间才得到这样的抗体，并随之成功地获得了Src蛋白。他们将这一蛋白命名为pp60v-src，意思是一个来源于病毒Src基因的被磷酸化了的分子量为60KDa的蛋白（phosphorylated protein）。

　　Src蛋白被磷酸化意味着两种可能：和Src蛋白一起被沉淀下来的复合物里还含有一种蛋白激酶，或者Src蛋白本身就是一种蛋白激酶，它可以将自己磷酸化。Erikson更倾向于后者。一年后，他们证实了Src蛋白具有蛋白激酶活性，并且认为发生磷酸化的氨基酸是苏氨酸。

　　Src蛋白是一个蛋白激酶的消息使得Tony Hunter有些坐立不安，他需要尽快确定他正在研究的和Src蛋白有类似功能的中T抗原蛋白（多瘤病毒组分）是否也是一个蛋白激酶，并且需要弄清是丝氨酸还是苏氨酸被磷酸化，这是当时两个已证实的可以发生磷酸化修饰的氨基酸。

　　1979年6月12日，Tony Hunter在Salk研究所做了第一次实验以确定中T抗原蛋白是否是一个蛋白激酶。他首先用32p标记中T抗原蛋白，再将之和中T抗原蛋白免疫沉淀复合物进行磷酸化反应，然后将磷酸化蛋白在酸性环境下水解成单个氨基酸，最后在pH1.9的酸性缓冲液中（保护已磷酸化的氨基酸）用纸相层析方法将这些单个氨基酸分开，和磷酸化苏氨酸或丝氨酸参照物进行对比，就可以知道是哪个氨基酸发生了磷酸化。

　　Tony Hunter在这天下午有些疲倦，他偷懒没有配制新的酸性缓冲液，而是用了一瓶反复使用过的酸性缓冲液进行纸相层析。第二天，在放射自显影的片子上，他发现磷酸化的氨基酸位于磷酸化苏氨酸和丝氨酸之间，说明既不是苏氨酸也不是丝氨酸发生了磷酸化。

　　Tony Hunter大学时主修化学，他的化学知识告诉他除了苏氨酸和丝氨酸，还有一个氨基酸也包含可以被磷酸化的羟基基团，这个氨基酸就是酪氨酸。利用他掌握的化学知识，Tony Hunter用一简单的方法制备了一些磷酸化酪氨酸，用于作为纸相层析电泳的参照物来确定他所发现的磷酸化氨基酸是否真的是酪氨酸。实验结果是肯定的。有趣的是，当他用新鲜配制的酸性缓冲液进行纸相层析时，他发现磷酸化酪氨酸和磷酸化苏氨酸完全重合，不能被分开。原来，那瓶反复使用过的酸性缓冲液的pH值已经不再是1.9，而是1.7，就是这微小的差别导致了两个磷酸化氨基酸在电泳场迁移的不同。Tony Hunter故意让新鲜配制的酸性缓冲液放置几天，用这些“老化”的酸性缓冲液，他再次肯定是酪氨酸被磷酸化。Tony Hunter后来将纸相层析电泳条件改进为在pH1.9和pH3.5的双向电泳，可以成功地将三种磷酸化氨基酸分离开来。

　　Tony Hunter用他建立的新方法重新检测了Src蛋白的激酶活性，发现Src蛋白实际上也是一个酪氨酸蛋白激酶，这一结论不久被Ray Erikson证实。随后，David Baltimore报道另一个逆转录病毒蛋白v-Abl也具有酪氨酸蛋白激酶活性。1980年，Stanley Cohen纠正了他们两年前关于表皮生长因子（EGF）受体是苏氨酸蛋白激酶的观点，证明表皮生长因子受体具有酪氨酸蛋白激酶活性。鉴于表皮生长因子受体活化和人类多种肿瘤密切相关，这一发现将酪氨酸蛋白激酶不仅和细胞生长，而且第一次和人类肿瘤发生发展联系起来。

　　在确定了Src蛋白是一个酪氨酸激酶后，寻找它的激酶底物就成了研究Src致癌机制的关键。Ray Erikson等发现纯化的V-Src或者C-Src在试管内可以导致很多蛋白质发生酪氨酸磷酸化，但是只有找到Src的真正生理底物才能解释Src致癌之谜。随着新技术例如蛋白质二维电泳尤其是酪氨酸磷酸化抗体的应用，一大批Src蛋白激酶的底物被鉴定。在这些底物中，Ras和PI3K现在被公认为最为重要的两个底物，它们和它们所在的信号转导通路控制着细胞增殖，细胞周期调控和细胞迁移等多种和肿瘤发生密切相关的细胞过程。

　　由于他的一次“偷懒”带来的发现以及酪氨酸蛋白激酶在细胞生长信号转导通路中的重要作用，Tony Hunter被称为“激酶之王”。2001年，FDA批准了第一个酪氨酸蛋白激酶抑制剂GLEEVEC用于治疗慢性髓性白血病，标志着人类终于有了第一颗肿瘤治疗的“魔法子弹”，而这距离Paul Ehrlich第一次提出“肿瘤治疗魔法子弹”的设想已过去了一百多年。