CRISPR若问鼎诺奖，谁将是大赢家？

　　2016年09月08日讯 CRISPR，这个几乎让每一个人在新闻或者报纸上看到过的词，便是科学发展史上少有的具有如此来势凶猛的突破性和革命性的技术。曾几何时，有三项技术最令我痴迷，并打算去研究，那就是Nuclear transfer、iPS及CRISPR，而我所做的研究都均涉及这三项技术，其中Nuclear transfer与ips在2012年荣膺诺贝尔生理医学奖，而CRISPR能否问鼎，笔者认为这只是囊中取物的等待时机的过程，或许就在下个月。这里，我想通过前段时间我工作报告ppt中的关于CRISPR的发展历程的原始文献资料来图文详解：CRISPR若问鼎诺奖，谁将是大赢家。

　　CRISPR，是clustered，regularly interspaced， short palindromic repeats的英文缩写，因为很长，我用逗号隔开容易理解，而这个缩写至今还没有对应的中文翻译，全称翻译成中文很拗口-“成簇的、规律间隔的、短回文重复”。而Cas指CRISPR-associated，如Cas genes、 Cas proteins。

　　早在1987年12月，日本大阪大学的Yoshizumi Ishino以第一作者身份在Journal of Bacteriology上发报道了E. coli的iap基因的编码序列附近存在5个高同源序列，且每个含29个碱基，这些序列之间又被32个碱基隔开，但是原文的最后说这些序列的生物学意义还是未知的。

　　1989年，西班牙的Fransisco J. M. Mojica开始在阿里坎特 （Alicante）大学读博士研究生，他老板之前发现培养基中的盐含量可能会影响地中海嗜盐菌 （Haloferax mediterranei） 限制性内切酶切割此微生物的基因-Psfl，并希望他把这课题再深入研究一下，果然Mojica在开始鉴定这一异样片段的时候，意外的发现在该基因的第一个DNA片段里，有一个奇怪的大致呈回文式对称得、有30个碱基并被36个碱基的间隔隔开的多拷贝重复序列的结构，而这个结构与任何已知的微生物的重复序列家族都不相同，该发现在1993年发表于Molecular microbiology杂志上。

　　随后，Mojica继续深入研究这一现象，他发现在与地中海嗜盐菌相近的沃氏嗜盐富饶菌（Hvolcanii） 和关系更远的嗜盐古菌中也存在类似的重复序列。这又一发现于1995年发表在同一杂志上。

　　接下来的时间里Mojica并没有放弃这项研究，他继续在20种不同的微生物上鉴定了这样的重复现象，这些微生物除了古细菌外，还包括结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis），艰难梭菌（Clostridium difficile）及鼠疫杆菌（Yersinia pestis），该发现在2000年再次发表在同一杂志上，在此文章中，Mojica把这个重复序列命名为Short Regularly Spaced Repeats （SRSRs），另外他即是第一作也是通讯作者。

　　2002年，荷兰乌得勒支 （Utrecht） 大学的Ruud. Jansen在Molecularmicrobiology杂志上发表了题为Identification of genes that are associated with DNA repeats inprokaryotes的文章，他们利用生物信息工具对一系列古菌和细菌的重复序列进行了分析。文章中，Jansen等人在Mojica的协商下（文章中致谢里面提到的），首次将这个重复序列命名为Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats， 简称CRISPR，这就是我们现在所通用的名称。同时，他们也首次用了CRISPR-associated（cas）这个概念。另外，他们对各种细菌和古菌的相关cas基因进行了鉴定，其中包括后面热门研究的嗜热链球菌（Streptococcusthermophiles） 与酿脓链球菌（Streptococcuspyogenes） 的cas3、cas4、cas1、cas2基因，在这篇文章中Jansen即是第一作也是通讯作者。

　　自2000年以后，Mojica继续坚持研究他发现的CRISPR，他也作为早期的CRISPR领域的领军人物，同时他想到了CRISPR对应的spacer可能也有一定的特殊功能，想搞清楚到底这些spacer究竟和什么基因或者序列相关。于是他用BLAST等生物信息工具，在一种大肠杆菌测序到的一个CRISPR基因位点上发现了其中一个spacer与一种P1 噬菌体的序列相匹配，而这个噬菌体能感染多种大肠杆菌。而具有这一间隔的大肠杆菌对P1 phas具有免疫力。这时候，他已经检索了4500个CRISPR spacers，发现其中88个间隔与已知序列相似，47个与细菌噬菌体相匹配。这时候，Mojica深刻的意识到CRISPR基因位点储存了用于为保护微生物抵抗感染的适应性免疫系统所需的信息。这篇CRISPR与immune在In Silico层面预测性相关性文章在2005发表于Journal of Molecular Evolution上。

　　2005年，在Microbiology杂志同期2篇文章同时再次报道了CRISPR spacer与噬菌体序列相匹配的在In Silico层面的研究。一篇为法国巴黎大学的G. Vergnaud团队通过对61种鼠疫杆菌分析发现这些密切相关联的分离株在串联重复基因位点上是一致的，CRISPR基因位有许多的新spacer与存在于鼠疫杆菌基因上的原噬菌体序列相匹配。因此，他们推测CRISPR基因位点是在执行防御机制。

　　另一篇为法国国家农业研究院的Alexander Bolotin以第一作与通讯作者身份发表了在In Silico层面的关于原核生物CRISPR结构中存在其本身染色体以外的序列，进而他们也推测和假设这些CRISPR的spacers可能为对抗噬菌体感染的细胞免疫应答。

　　上面Mojica，Vergnaud与Bolotin在In Silico层面发现了CRISPR的spacer与噬菌体相关性，但是还没有实验证据的文章来阐述这个事实。直到2007年，法国Danisco公司的Philippe Horvath与其同事Rodolphe Barrango在Science杂志上正式发表了题为CRISPR Provides Acquired Resistance AgainstViruses in Prokaryotes的研究论文证明了这一事实。在这项研究中，首先他们把野生型（WT）的嗜热链球菌与噬菌体一起培养后，获得了9个能够对噬菌体抵抗的突变菌株，然后对其CRISPR序列分析后，将其CRISPR 的一些列spacer （S1-14）序列再次插入WT菌株后，其也产生了对噬菌体的抵抗能力。同时他们也发现在那些侵蚀WT嗜热链球菌的噬菌体的基因组中有S1-14的序列。另外，他们也研究了cas基因的作用，发现该菌株需要cas7来获得抵抗力，但已经具有抵抗力的细菌再不需要这个基因。同时也发现另一个基因cas5对于该细菌对抗噬菌体是必须的，那个时候，Cas5指的就是现在大名鼎鼎的Cas9。

　　2008年8月，荷兰瓦赫宁根（Wageningen）大学的John vander Oost等人在Science上发表了第一个直接由程序设计的基于CRISPR的免疫的实验论文。首先他们鉴定了大肠杆菌K12的CRISPR/cas系统，发现其包括cas3、casABCDE、cas1及cas2等8个基因，其中casABCDE称为Cascade。通过Cascade的每一个基因逐一剔除，证实了Cascade能够将CRISPR前体cleave为 57nt的CRISPR RNA （crRNA），进一步对crRNAs测序发现，其从8个碱基的重复序列开始，紧随其后的是完全间隔和新重复区的出现。接下来，他们用实验证实了crRNA是产生源于CRISPR的噬菌体抵抗的原因。他们将人工设计的CRISPR序列插入大肠杆菌，果然携带新的CRISPR序列的品系对噬菌体呈抵抗。

　　对于上面的荷兰著名科学家 Oost，我还想再另提及一下，他于2014年在Nature发表了一篇题为DNA-guided DNAinterference by a prokaryotic Argonaute的文章，他们发现古细菌Thermusthermophilus的Argonaute （TtAgo） 保护其不受DNA而不是RNA入侵，而TtAgo的功能是通过DNA引导干扰DNA的宿主防御的文章。他们从该细菌中纯化了TtAgo，发现5'-磷酸化的单链DNA能够指导TtAgo在75℃高温条件下断裂质粒DNA。

　　Oost的这篇文章出来后，可能引起了河北科技大学韩春雨副教授的高度重视，他的研究团队于2016年5月2号在NatureBiotechnology杂志发表了一篇题为DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute的Article文章（与上面文章的题目都很相似），他们声称利用古细菌-格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi） 的Argonaute （NgAgo） 在37℃条件下实现了DNA引导的基因组编辑，并发现NgAgo作为一种DNA介导的核酸内切酶，适合在人体细胞中进行基因组编辑。

　　此研究论文刚在线发表便引起中国学术界和媒体界的巨大轰动，有人预言可能冲击CRISPR而获得诺奖，也被一些媒体定为诺贝尔级别的研究成果。但是至今天4个月零5天过去了，还未见再次利用NgAgo在人体细胞进行有效基因编辑的正式研究论文。

　　其实对于Argonaute蛋白人们并不陌生，在人类有8中已知的Argonaute蛋白家族，其在RNA silencing processes中起重要作用。但是在真细菌和古细菌中的Argonaute的作用却了解甚少。而今年4月12号 （早韩春雨不到一个月时间），CRISPR先驱加州大学伯克利分校Jennifer Doudna就在PNAS发表了一篇关于Ago蛋白与CRISPR相关的文章，他们发现在Marinitoga piezophila菌的Argonaute（MpAgo） 利用5'-羟基化的gRNA能够断裂单链靶向的DNA序列。

　　我们继续回到CRISPR。尽管上面Oost预测CRISPR的靶向目标不是RNA而是DNA，但是还没有直接的实验证据。直到2008年底，美国西北大学的Luciano Marraffini等人在Science杂志发表论文证实了这一结论。他们对表皮葡萄球菌 （Staphylococcus epidermidis）的CRISPR系统定向射靶的质粒中的切口酶基因进行了改变，即在它的序列中间插入一个自我剪接的内含子。若CRISPR是以mRNA为目标，其不会影响干扰功能。若CRISPR是以DNA为目标，那么这个插入的内含子会影响干扰功能。他们的结论就是CRISPR的目标是DNA。这时候，他们认识到CRISPR在本质上是一种可编辑并能设计的限制性内切酶。在文章的最后，他们也预示了CRISPR可以被设计后，利用在其他异源性系统内进而进行基因组编辑。

　　2010年，加拿大拉瓦尔（Laval） 大学的SylvainMoineau团队在Nature杂志上以Article形式报道了嗜热链球菌 （Streptococcus thermophiles）的CRISPR/Cas9系统是由crRNAs指引并且在DNA中产生双链裂断。他们也发现了CRISPR/Cas9系统在断裂噬菌体双链DNA的时候是在proto-spacer位点。

　　2011年3月，当时还在瑞典于默奥大学的法国女科学家Emmanuelle Charpentier在Nature以Article形式发表了关于发现CRISPR/Cas系统的tracrRNA （trans-activating CRISPR RNA） 的开拓性的研究论文。这篇文章中，Charpentier等人对S. pyogenes通过dRNA-seq（differential RNA sequencing） 分析，发现了一个25nt、与CRISPR重复序列近乎完美地互补tracrRNA，其与csn1参与RNAase III对CRISPR转录出序列的选择性酶切而产生crRNA，随后csn1、tracrRNA和crRNA形成的复合物可对与crRNA配对的外源DNA实施切割。这里的csn1便是以后重新命名的大明星Cas9。

　　2011年8月，立陶宛维尔纽斯 （Vilnius） 大学的VirginijusSiksnys在Nucleic Acids Research杂志上发表了关于首次利用在远缘细菌物种内重建CRISPR的研究论文。他们将Sthermophiles的整个CRISPR基因位点转入远缘的E. coli内，发现了其足以实现对质粒和噬菌体DNA的靶向干扰。

　　2012年8月，Doudna与Charpentier两个团队合作在Science杂志发表了关于利用CRISPR/Cas系统在体外对DNA进行精确切割的具有开拓性的研究论文。在此文中，他们对WT的S. pyogenes的CRISPR/Cas系统进行改造，将tracrRNA和crRNA整合为一条单链，称为crRNA：tracrRNA chimera （本文中又称chimeric RNA），其具有两个特性，一个位于5’端与靶序列互补的20个核苷酸（crRNA作用），另一个为3’端被Cas9识别的双链发夹结构（tracrRNA作用），该chimeric RNA与靶DNA相应序列互补配对可启动核酸内切酶Cas9的活性，进而让Cas9的HNH结构域与嵌合RNA互补的链切开，同时Cas9的RuvC样结构域将非互补链切开，见上图，右侧照片为Doudna （右） 与Charpentier （左）。此项研究奠定了CRISPR/Cas系统作为基因组编辑基础，也成为让该项技术发明的一个里程碑。文章的最后，Doudna与Charpentier也预示了该项研究可以和ZFNs和TALENS一样，可能作为另外一种选择性的有效的RNA指导的基因编辑方法。

　　前面关于CRISPR/Cas系统的重要元素都被基本搞清楚了，比如对于S. pyogenes来讲包括Cas9，crRNA、tracrRNA及PAM （protospaceradjacent motif）。接下来做的事就是将这些必需元件组装起来转入到人的细胞，看能否WORK。

　　于是，2013年1月3号在线发表了Feng Zhang团队发表了关于利用CRISPR/Cas系统实现对人类细胞进行基因组编辑的研究论文。该项研究就是用了之前Doudna与Charpentier研究成熟并命名的S. pyogenes的CRISPR/Cas系统，包括Cas9、chimeric RNA及PAM。Zhang在人的癌细胞系HEK 293FT 与 N2A 当中实现。

　　重要并巧合的是，在2013年1月3号的Science文章同时也刊登了哈佛大学George M. Church团队的关于利用CRISPR/Cas系统实现对人类细胞进行基因组编辑的研究论文。与上面不同的是，Church等人将S. pyogenes的crRNA-tracrRNA fusion transcripts命名为了gRNA（guide RNA），基因组编辑的人的细胞不仅仅有癌细胞系293T和K562，还有更为重要的正常的人的ips细胞，也就是说该项研究是第一次利用Cas9对正常人细胞及干细胞的基因组编辑。

　　还有一项非常重要的研究，那就是2013年1月29在eLIFE杂志报道了Doudna利用S. pyogenes 的CRISPR/Cas系统实现对293T细胞进行基因组编辑的研究成果。这篇文章里Doudna首次将前面的chimeric RNA正式命名为目前通用的sgRNA （single-guide RNA ）。

　　这里我们可以看到，如此疯狂研究的CRISPR/Cas系统，在2013年的1月同时有3篇文章报道了利用其对人类细胞进行基因组编辑。

　　接下来，Doudna在2014年3月在Science杂志报道了S. pyogenes apo-Cas9的晶体结构。

　　2014年2月底，Zhang联合日本东京大学的Osamu Nureki在Cell杂志报道了S. pyogenes Cas9-sgRNA复合体的晶体结构（Zhang应该不像Doudna专做生物结构，只能拉个大牛一起研究）。

　　2015年11月，Doudna又在Nature杂志报道了S. pyogenes的Cas9的HNH结构域的构想状态直接控制了靶向DNA切割的活性。他们利用分子内荧光共振能量转移技术，揭示了HNH核酸酶结构域的一种激活构象，并正式了一个完整的扩展α-螺旋充当了变构开关，将HNH的构想改变传达给Ruvc结构域，激活其实现DNA切割。

　　2016年2月，Doudna再次在Science杂志报道了捕获S. pyogenes的Cas9蛋白进行DNA编辑时的3D图像，这些图像表明Cas9与DNA链之间发生相互作用会导致DNA链发生弯曲形成一定角度，引起DNA和RNA链在特定位置形成R环。

　　在2014年，Doudna、Charpentier，Zhang均在顶级学术期刊发表了关于CRISPR-Cas的Review，前两人合作发表在Science杂志，后者与Patrick D. Hsu及Eric S. Lander合作一起发表在Cell杂志。我在细读他们的文章时发现：在2篇文章中都用了时间轴描述CRISPR-Cas的重大事件，Zhang在描述2013年第一次实现人类基因组编辑的时候，仅应用了他和Church的文献，而没有提及Doudna在eLIFE的文章，而后者却均提及同年同月的这三篇实现人类基因组编辑的重要文章。

　　2016年3月，美国沃伦·阿尔珀特奖基金会（Warren Alpert Prize Foundation） 授予5位对理解CRISPR的细菌防御系统及其在基因编辑方面的革命性发现做出重要贡献的杰出科学家，包括Barrangou、Doudna、Horvath、Siksnys及Charpentier （这里没有Zhang与Church）。