生物谷专访国际抗体验证工作组（IWGAV）Dr Anita Bandrowski

　　2016年10月19日讯 近年来，科学家们发现越来越多通过抗体获得的高影响力研究成果却无法被重现，这个"重现危机"引起了人们对抗体质量和一致性的担忧，据估计，在美国和全世界使用特征不明确的抗体浪费金额每年分别高达3.5亿和8亿美元。

　　国际抗体验证工作组（IWGAV）是由蛋白质生物学领域中不同研究方向的国际科学家组成的一个独立小组，致力于优化抗体的使用和验证标准，同时，IWGAV也是首家为抗体生产商和使用者制定抗体验证策略的组织。由赛默飞世尔科技提供资金成立的国际抗体验证工作组在Nature Methods发表了首篇关于验证抗体特异性策略的提议。

　　生物谷：IWGAV是在怎样的契机下与赛默飞合作成立，您能为我们简单介绍一下吗？

　　Dr. Anita Bandrowski：很多科学家认识到需要建立一套广泛认可的抗体验证标准，其中就包括很多在赛默飞世尔科技供职的科学家。赛默飞世尔科技致力于为科学家提供更好的服务，所以赛默飞世尔科技和国际抗体验证工作组有了合作，出资将关心这一问题的科学家汇聚成一个组织，也就是所谓的"国际抗体验证工作组（IWGAV）"，Thermo并不直接参与该组织的工作--例如选择会员--这是确保这个公正的组织成立的关键步骤。2015年9月开始，IWGAV开始着手制定行业标准并帮助攻克抗体特异性和可重复性相关的难题。

　　生物谷：此前，国际上尚未就抗体的抗体验证和特异性检测标准达成共识，IWGAV选择基因策略、正交策略、独立抗体策略、标签蛋白的表达和免疫捕获及质谱分析（MS）作为标准，依据是什么呢？

　　Dr. Anita Bandrowski：五个支柱策略引发了关于验证抗体特异性的应用验证标准的迫切讨论，我们选择这五个支柱策略是因为它们能够提供证明抗体和其靶标结合的证据，并且在大多数情况下可评估测试条件下可能存在的交叉反应性。每种策略都有其最适合的一系列特定应用。

　　我们也考察了其它特异性评估方法（例如亲和性测定、DNA测序、同位素测定等等）。遗憾的是，它们并不直接测定抗体特异性或交叉反应性，因而无法将其作为验证抗体特异性的主要方法。

　　生物谷：抗体具有特异性，目标应用也各不相同，IWGAV提案中的五种策略在验证不同抗体时有什么优势？

　　Dr. Anita Bandrowski：进行抗体验证的关键在于，确保抗体能特异性识别其预期靶标并持续保持相似的性能，从而让所有按照正确实验方案操作的用户最终都能获得相同的结果。

　　这些由IWGAV提出的验证策略是验证抗体特异性并提升科学发表成果可重复性的第一步。在这里我必须强调的是，重复验证科学发表成果的最初几步正如根据配方制作北京烤鸭一样，首先必须能获得所有配料。用于产生科学发表成果的研究工具--例如抗体--必须易于获得，其工作性能必须和公司所承诺的一样，并且必须和科学家在特定条件下的测定结果相吻合。

　　上述每一步都需要一些标准（例如五个支柱策略）规范，从而给所有人一套具有相对排序的选项，判定某项验证策略适合于某项实验方法的程度。此外，虽然我们提出的策略适用于例如多克隆和单克隆抗体等传统免疫试剂，对于其它重组或合成的结合物也同样适用。

　　生物谷：众所周知，由于抗体未经验证给科研造成了很多损失，IWGAV提案中的五种策略可以为科学家和抗体生产商带来怎样的变化？对于这些策略的实际运用，您有哪些建议？

　　Dr. Anita Bandrowski：未经充分验证的抗体可能产生不可靠的结果，从而浪费时间、精力、材料和金钱。最坏的结果是，如果科学家未觉察到自己的抗体未经充分验证，可能将导致科学结论错误。事实上，基于未知试剂做出科学结论可能造成的问题会严重的多，因为这时将无从判定公司是否进行了合适的验证。这些支柱策略的建立能够提供验证常用抗体的最佳方法，并且它们都是基于一个理念--即我们可以对所用的抗体进行鉴定。

　　就实际应用而言，科学家应坚持进行广泛的验证测试和靶标鉴定，尤其是当抗体厂商未提供这些数据时。这些举措包括，在论文中发表尽可能多的信息--如验证抗体特异性的方法、货号和批号，如果可能的话还要附上文献标识码（RRIDs）--以确保研究所用试剂（如抗体）非常明确。

　　厂商则应通过各种可用的技术（如CRISPR、免疫捕获及质谱分析、标签蛋白表达、siRNA、抗体验证和正交策略）验证抗体与靶标的结合，并对每一新批次进行重复验证实验以确保相关数据及时更新。重要的是，公司提供的数据应当具有批次特异性，以便科学家看到自己实验室所用抗体的验证数据，这些数据包括在哪里、何时及由谁进行验证。

　　此外，实际应用步骤可能需要一个受信任、公正的第三方来验证这些信息。抗体行业被媒体曝光了很多问题，所有抗体公司都须努力重新赢得科学业界的信任，而其中一个举措便是为了确保抗体有效性的最新努力成果能够获得独立组织的认可。另一选择是由独立实验室进行测试，或由并不知道测试的抗体种类的抗体公司测试。未经独立测试，我担心网站上的"验证"字眼无法获得预期的说服力。同样，赛默飞世尔科技公司也是RRID倡议的强力支持者，倡导科学家在发表论文时适当指出他们的研究资源。

　　生物谷：IP-MS技术发展迅速，依据IWGAV提出的五种策略思路，赛默飞推出了新型IP-MS和Q Exactive 质谱仪组合，您认为赛默飞最新产品在这些方面是否有所突破？

　　Dr. Anita Bandrowski：IWGAV的一大支柱策略就是免疫捕获厚进行质谱分析，这是确定蛋白结合脱靶效应的最佳方法。赛默飞世尔科技的IP-MS技术秉承同样的理念，能够帮助确定蛋白靶标的特异性，找出可能的非特异性脱靶目标，证明已知结合蛋白的富集，从而最终鉴定出特定实验条件下的最具特异性的抗体。

　　IWGAV独立于赛默飞世尔科技运行，我不能为其背书，但我相信赛默飞世尔科技IP-MS技术将为研究者提供更多数据和有关抗体特异性的精确信息。作为IWGAV成员，这是我一贯推崇的做法。事实上，我更乐于看到Thermo Fisher Scientific等热心厂商一直不懈地提升自己的抗体有效性和一致性，以便更好地服务于生物医学研究。

　　编者注：IWGAV确定了五个支柱策略，以指导通过特定应用进行抗体验证的方式：

　　基因策略：利用CRISPR/Cas 或RNAi等技术，将对照细胞或组织中的目标基因敲除或敲低，并检测这些对照细胞或组织中的相关信号。

　　正交策略：使用非抗体依赖方法对大量样品进行定量，并检测基于抗体和非抗体定量间的相关性。

　　独立抗体策略：使用2种或多种可识别目标蛋白表面不同抗原决定簇的独立抗体，并通过对比或定量分析确定特异性。

　　标签蛋白的表达：为内源性目标基因添加亲和标签或荧光蛋白标签。利用抗体检测方法可对来自标签蛋白的信号进行校正。

　　免疫捕获及质谱分析（MS）：免疫沈淀（IP）技术可通过使用与目标蛋白特异性结合的抗体分离出目标蛋白，其与MS分析结合（IP-MS）可识别与纯化抗体直接发生相互作用的目标蛋白以及可能与目标蛋白形成复合物的蛋白。