扫盲贴：如何评估NGS文库的质量？

　　2016年10月03日讯 NGS文库制备的目标是在DNA或cDNA片段上连接厂家特异的接头，让它们能够在NGS平台上测序。这个概念似乎非常简单，不过实现这个目标可比你想象的要复杂得多，而只有严格的质量控制才能确保最佳的结果。近日，QIAGEN的产品专家Verena Schramm就介绍了这一过程。

　　她认为，成功测序的两个决定因素是文库材料的质量和数量。评估片段的大小分布以及文库的准确浓度是两个关键的参数，可帮助你评估文库的质量。除了这两个标准的质量指标，下面还有一个重要指标，可帮助你判断文库制备的整体质量。

　　转化率

　　转化率指的是有多少起始分子被转化成“可测序的”片段，或者两端加上接头的片段。一种简单的计算方法是将测得的文库产量除以理论的最高产量。在计算过程中，PCR的扩增效率和纯化过程中的损失必须考虑进去。此外，我们还要考虑到，qPCR文库定量方法不能区分特异文库和接头二聚体，不适合接头二聚体浓度高的片段。对于这种文库，建议使用电泳方法来定量，如QIAGEN的QIAxcel或安捷伦的Bioanalyzer。

　　例如，假设PCR扩增效率为95%，而纯化过程损失20%的样品，那么理论上的最高产量如下：

　　转化率的定义为测得产量与理论最高产量之间的比值。它在很大程度上受到连接效率的影响。因此，对于好的文库制备试剂，它的酶和缓冲液配方必须经过优化，以确保连接效率最高。

　　复杂度

　　在文库制备过程中，若转化率高，偏向性少，则能从样品中捕获更多独特的分子。更多独特分子被测序，这意味着数据集中的重复读取更少。重复读取不能带来有意义的信息，可能导致变异频率改变。因此，在数据分析时需要去除重复读取。

　　确定复杂度的另一个重要因素是文库制备的样品量。样品量越低，NGS文库的复杂程度就越低。因此，对于低于纳克级的样品，高的连接效率和转化率是尤为重要的，这才能尽可能地捕获有限样品中的最大复杂度。

　　均一性

　　覆盖均一性指的是读取在基因组或目标区域内的分布均一程度。覆盖越均匀，达到特定深度所需的测序就越少。覆盖均一性的偏向通常是在文库制备和文库扩增步骤中引入的。在很多时候，覆盖均一性表现出明显的GC偏向，也就是说，覆盖更少或更多，这取决于GC含量。

　　准确性

　　NGS文库制备的准确性越高，你对变异报告的信任程度就越高。核苷酸错误通常在PCR扩增以及测序过程中引入。测序错误通常低于1%。通过使用高保真PCR试剂，可尽量减少文库扩增的错误。NGS对照样品也有助于评估NGS流程的准确性。

　　在文库制备过程中，这些关键的质量指标都必须考虑，才能获得更好的结果。如有兴趣，可了解QIAGEN的QIAseq NGS产品组合。