Nature Biotechnology聚焦新一代CRISPR系统Cpf1

　　2016年07月02日讯 来自麻省总医院、哈佛医学院的研究人员，解析了新一代的CRISPR-Cas Cpf1核酸酶在人类细胞中的全基因组特异性。研究结果发布在6月27日的《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上。

　　麻省总医院病理学系研究员及研究副主任J. Keith Joung博士及研究员Benjamin P Kleinstiver博士是这篇论文的共同通讯作者。近年，Joung在CRISPR研究中取得了大量重要的研究成果。

　　2014年，Joung领导麻省总医院的研究人员开发了新一代的基因组编辑系统，可大大降低生成不必要的、脱靶基因突变的风险。在发表于Nature Biotechnology杂志上的一篇论文中，作者们报告称，一种新型的基于CRISPR的RNA引导性核酸酶技术通过利用两条引导RNAs，大大降低了在错误的位点切割DNA链的机会（Nature子刊：新技术显著提高CRISPR系统精确性 ）。

　　同年12月，Joung研究团队还开发出了在基因组范围内检测CRISPR脱靶效应的全新方法，。这一成果发表在Nature Biotechnology杂志上（Nature Biotechnology：CRISPR脱靶的全基因组图谱 ）。

　　2015年6月，Joung研究小组找到了一种新方法来扩大强大基因编辑工具--CRISPR-Cas9 RNA引导核酸酶的使用及提高其精确性。他们的研究论文发表在Nature杂志上（Nature发布CRISPR-Cas9重大新成果 ）。

　　在2016年Nature杂志上的一篇研究论文中，Joung描述了改造Cas9酶，减少它与靶DNA的非特异性互作，大大扩展这一基因编辑技术应用的过程。这种改良版本的新型基因编辑CRISPR-Cas9核酸酶似乎可以强有力地消除当前这一技术一个非常重要的限制：不必要的脱靶DNA断裂，将它们降低至无法检测到的水平（Nature发布突破性CRISPR-Cas9新技术 ）。

　　CRISPR系统编码的RNA引导核酸内切酶对于细菌适应性免疫至关重要。CRISPR-associated （Cas）核酸酶可以很容易被重编程来切割靶DNA序列，在各种生物体中实现基因组编辑。其中的一类核酸酶Cas9蛋白与两种短RNAs：crRNA和tracrRNA形成复合物。最常用的Cas9直系同源物SpCas9利用了在5′末端包含20个核苷酸（nt）与靶DNA位点“前间隔序列”（ protospacer）区域互补的crRNA。crRNA和tracrRNA通常结合成大约100-nt的单导向RNA （gRNA），指导SpCas9的DNA切割活性。有效地切割还要求SpCas9识别前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif,PAM）。当前，研究人员已采用许多不同的方法确定了SpCas9核酸酶与不同gRNAs配对的全基因组特异性。并构建出了一些全基因组特异性显著增高的SpCas9变体。

　　近期，科学家们发现了一种叫做Cpf1的Cas蛋白，证实也可以重编程它来切割靶DNA序列。不同于SpCas9，Cpf1只需要一个42-nt的crRNA，这一crRNA在它的3′端有23 nt与靶DNA序列的前间隔序列互补。此外，SpCas9识别的是前间隔序列3′端的NGG PAM序列，而AsCpf1和LbCpf1识别的是前间隔序列5′端的TTTN PAMs。早期的一些实验表明，可以重编程AsCpf1和LbCpf1核酸酶来编辑人类细胞中的靶位点，但只在少量位点对它们进行了测试，且尚未确定它们的全基因组特异性。

　　在这篇文章中研究人员证实两种Cpf1核酸酶AsCpf1和LbCpf1在人类细胞中的打靶效率与广泛使用的SpCas9相当。他们还证实利用来编程Cpf1核酸酶的crRNA 3′端有4-6个碱基对单碱基错配不敏感，而crRNA这一区域的许多其他碱基则对单碱基或双碱基替换高度敏感。针对两种Cpf1核酸酶采用GUIDE-seq测序方法和靶向深度测序分析，他们证实与20种不同的crRNAs配对一半以上的无法检测到脱靶切割。

　　这些研究结果表明AsCpf1和LbCpf1在人类细胞中具有高度的特异性。