Science：重磅！史上首次利用CRISPR-Cas9让人细胞变身为记忆存储系统

　　2016年08月21日讯 在一项新的研究中，来自美国麻省理工学院（MIT）的研究人员设计出一种方法在人细胞的DNA中记录复杂的历史事件，从而允许他们通过对这种DNA进行测序从中找回过去事件的“记忆”。相关研究结果于2016年8月18日在线发表在Science期刊上，论文标题为“Continuous genetic recording with self-targeting CRISPR-Cas in human cells”。论文通信作者为MIT电学工程与计算机科学副教授和生物工程副教授Timothy Lu。论文第一作者为Samuel Perli博士和研究生Cheryl Cui。

　　这种模拟记忆储存系统---首先能够在人细胞中记录事件的持续时间和/或强度---可能也能够允许科学家们研究干细胞在胚胎发育期间如何产生多种组织，细胞如何对环境条件作出反应以及它们如何发生导致疾病产生的基因变化。

　　Lu说，“为了能够更加深入地理解生物学，我们对人细胞进行基因改造，使得它们能够基于基因编码的记录器报道它们自己的历史事件。”他补充道，这种技术应当允许深入认识基因调节和细胞内发生的其他事件如何导致疾病产生和发育。

　　模拟存储器

　　包括Lu在内的很多科学家已开发出多种方法在活细胞中记录数字信息。他们利用重组酶对细胞进行编程，使得它们在一种特定的事件发生---如接触一种特定的化学物---时翻转它们的DNA片段。然而，这些方法仅揭示出这种事件是否发生，而不能揭示出接触多少数量的化学物或者这种接触持续多长时间。

　　Lu和其他的科学家之前设计出方法在细菌中记录模拟信息，但是迄今为止，还没有人在人细胞中做到这一点。

　　在当前的这项研究中，由MIT开发出的这种新方法是基于基因组编辑系统CRISPR-Cas9实现的，其中这种系统是由一种DNA切割酶Cas9和一种引导这种酶结合到基因组特定位点上并指导它在这个位点进行切割的短链RNA---也被称作向导RNA（gRNA）---组成的。

　　CRISPR-Cas9被广泛地用于基因编辑，但是Lu团队决定对它进行改编用于记忆储存。在最初进化出CRISPR-Cas9的细菌中，这种基因组编辑系统记录过去的病毒感染，这样细菌细胞就能够识别和抵抗再次入侵的病毒。

　　Perli说，“我们对这种CRISPR-Cas9系统进行改编以便在人基因组中储存信息。”

　　当利用CRISPR-Cas9对基因进行编辑时，研究人员构建出能够匹配宿主基因组中靶序列的gRNA。为了进行记忆编码，他们采取一种不同的方法：他们设计出识别编码这种gRNA的DNA序列的gRNA，从而产生他们称之为“自我靶向的gRNA（self-targeting guide RNA）”。

　　在这种自我靶向的gRNA的引导下，Cas9切割编码这种gRNA的DNA序列，产生一种永久性记录事件发生的突变。这种DNA序列一旦发生突变就会产生新的gRNA来引导Cas9靶向这种新近发生突变的DNA序列，而且只要Cas9是有活性的或者这种自我靶向的RNA仍然表达，就允许突变进一步发生和积累。

　　通过细胞内的感应器检测特定生物事件发生来调节Cas9或自我靶向的gRNA的活性，这种系统就能够允许累进性突变作为这些生物事件的函数积累下来，因而提供基因组编码记忆。

　　比如，研究人员对一种基因回路进行改造，使得它仅当靶分子--如炎症期间免疫细胞产生的TNF-α---存在时表达Cas9。每当TNF-α存在时，Cas9切割这种编码gRNA的DNA序列，产生突变。接触TNF-α的时间越长或者TNF-α浓度越大，这种DNA序列就会积累越多的突变。随后通过对这种DNA序列进行测序，研究人员能够确定接触多少数量的TNF-α。

　　Perli说，“这就是我们一直在寻找的模拟行为：当增加TNF-α的接触时间或数量时，就能够增加突变发生的数量。”

　　Cui说，“再者，我们想要在活的动物体内测试我们的系统。能够在小鼠的活细胞中记录和提取信息能够有助解答有意义的生物学问题。”研究人员证实这种系统能够记录小鼠体内的炎症。

　　大多数突变导致这种DNA序列发生部分缺失，因此研究人员让他们设计的gRNA长度比通常的20nt（20核苷酸）要长，因此它们不会变得太短而不能发挥功能。长40nt的DNA序列比人细胞记录一个月发生的事件所需的足够长的DNA序列还要长，而且研究人员还设计出长70nt的DNA序列，它们能够被用来记录更长时间发生的生物学信号。

　　追踪发育和疾病

　　研究人员也证实他们能够通过导入多种自我靶向的gRNA对人细胞进行基因改造，使得它们同时检测和记录至少两种生物学事件。每种gRNA与一种特定的事件相关联，而且仅当这种事件发生时才产生。在这项研究中，研究人员证实他们能够记录抗生素强力霉素和一种被称作IPTG的分子的存在。

　　研究人员说，这种方法当前最有可能被用来研究人细胞、组织或工程器官。通过对人细胞进行编程使得它们记录多种事件，科学家们能够利用这种系统监控炎症或感染，或者监控癌症进展。它也可能被用来追踪干细胞在动物从胚胎发育到成年时如何产生不同的组织。

　　Perli说，“利用这种技术，你能够拥有不同的存储寄存器来记录细胞接触到的不同信号，而且你能够观察到这种细胞接收到的每种信号的持续时间或强度。这样你能够更加接近一步理解在发育中发生什么。”