结构生物学家有望翻开可视化大分子结构的新篇章

　　2016年08月24日讯 结构生物学家一直希望能可视化大分子结构，从而探索其功能。但这需要整合多种技术，十分复杂。与其他结构生物学家一样，加利福尼亚大学（University of California）的Eva Nogales碰上了好时代。Nogales现在可以利用工具解决几年前根本无法解答的分子机器相关问题。

　　Nogales和Jennifer Doudna--是的，就是大名鼎鼎的CRISPR-Cas9发明人--最近在合作的一个项目就是在探索这样的问题。很多情况下，在DNA被CRISPR-Cas9剪切前，细胞内会形成一个由核苷酸构成的R环，Doudna和Nogales都对这个R环非常感兴趣。Nogales等人对化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）中的R环进行了成像，得到了近原子分辨率的结构图像，提示了在特定位点Cas9酶如何打开DNA。

　　这项工作最突出的两个亮点是：1，科学家们快速地将功能与结构联系了起来；2，他们把成像方法结合了起来。一个多世纪以来，结构生物学的首选方法一直是X射线晶体衍射法。但有些生物分子太大或太小，难以结晶，因此不能采用X射线法。一些分子在发挥功能时，会发生形态或朝向的变化，而结晶法无法捕捉这些动态变化。

　　现在，科学家们有一个庞大的成像工具库作为晶体法的补充。一些方法，如低温电子显微镜（cryo-EM）或化学家的核磁共振（nuclear magnetic resonance， NMR）成像，都能在不结晶的情况下，获得接近原子分辨率的结构图像，揭示分子的形状、大小和方向。但并非所有的方法对细胞内所有蛋白质、核酸都有用。

　　经验证明，没有一个单一的方法足以探讨在细胞中发生的动态行为和复杂的相互作用。最好的解决办法是整合来自多个方法的图像。

　　这种方法得到了诸多研究者的支持。加利福尼亚斯坦福大学（Stanford University）的结构生物学家Roger Kornberg指出，每个[方法]都能提供一些重要信息，结合起来，能实现1+1>2的效果。Kornberg由于在揭示基因转录的机制方面的杰出贡献于2006获得了诺贝尔化学奖。对于这一突破性的研究，他使用的是X射线晶体衍射法。现在，和其他的晶体学家一样，他开始使用多种方法的结合。

　　Kornberg继续分析RNA聚合酶II，但现在他把冷冻电镜和晶体学结合起来。冷冻电镜可用于不易结晶的分子，并且可用于解析较大的分子，但目前分辨率还比不上晶体学。Kornberg的实验室还使用化学交联和质谱来揭示邻近蛋白质之间的关系，以及利用已知蛋白质的信息进行同源性建模。

　　Nogales和Doudna的团队也使用混合方法来研究R环。Nogales表示，高分辨率的X射线晶体法无法解析完整的R环结构，所以他们用低分辨率的冷冻电镜对完整的环结构进行解析。只有把两者结合起来，研究者们才能真正揭示CRISPR-Cas9系统中R环的作用。

　　这种混合或综合性方法有助于研究人员深入研究基础科学问题，对药物开发者也非常有用。细胞膜上发现的大蛋白质往往是治疗靶标，高分辨率混合方法能揭示药物与受体相互作用的原子细节。同样，通过展示艾滋病毒、埃博拉病毒和其它病原体的包装蛋白与免疫细胞相互作用的机制，诱导保护性反应，混合方法可能能够帮助疫苗的发展。纳什维尔范德堡大学（Vanderbilt University）的结构生物学家Jens Meiler表示，这些结构对于人们理解免疫系统的工作机制非常重要。

　　Noglaes总结到：这是混合方法的黄金时代。

　　梦想成真

　　欧洲分子生物学实验室（European Molecular Biology Laboratory， EMBL）细胞生物和生物物理部负责人Jan Ellenberg表示，这个时代对很多生命科学家来说，是梦想成真的时代。这个梦想是从原子层面无缝衔接到细胞层面。这样深入的理解自然能解答结构生物学的首要问题：一个分子的结构是怎么和其功能联系在一起的？

　　结构生物学家工具箱中的每一种技术都提供了不同的视角。生物学家相信，使用混合方法构建的模型可以准确地反映分子或复合体在细胞中的行为。Meiler认为，你需要把这些技术结合起来，才能得到全面的答案。

　　X射线晶体长期以来一直是确定蛋白质原子结构的标准方法。成立于1971年的蛋白质数据银行（Protein Data Bank， PDB）拥有的大约120000个模型中，约有90%来自晶体学研究。

　　但X射线晶体虽然分辨率高，但也具有局限性。首先，样品要高度纯化，以产生有序的晶体。科学家通过分析原子如何散射光来确定原子排布，从而确定分子结构。该技术需要有足够的原子，以产生可测量的衍射图案。并且每一个晶体必须是静态的。因此，该方法不能揭示一个分子是如何运动的，以及如何起作用的，也不能揭示它是如何与其它系统互动的。

　　德国复杂系统研究所（Institute of Complex Systems）计算结构生物学小组组长Gunnar Schr？der指出，蛋白质不仅仅是一个单一的静态结构，通常情况下，你想看到的是蛋白质的整个功能。Schr？der使用混合方法来理解蛋白的行为和与其它蛋白的互动。晶体能提供蛋白在脱离正常环境时的一个构象的快照。他还表示，结构生物学家需要其它方法来补充晶体结构的信息，并提高他们对蛋白质的形态和功能的理解。

　　许多蛋白质，如细胞膜上的药物靶点，是灵活而不稳定的。为了让这些蛋白质形成晶体，研究人员经常要在某种程度上改变它们。Meiler指出，改变样本可能无法准确反映分子的原生状态以及其在细胞内的排布方式。他把实验和计算的方法混合，从而更好地理解分子结构。他继续表示，对于很多生物系统来说，晶体法是很好的初始方法，但这个方法不足以提供功能方面的信息。

　　生物学家现在正在利用一系列的工具来建立更丰富、更精确的生物结构模型。混合方法得到的信息远比单一方法丰富。冷冻电镜和晶体法的结合就非常强大。虽然冷冻电镜于20世纪80年代就问世了，但直到最近几年才取得了分辨率上的突破，达到了2.2埃的分辨率，非常接近X射线结晶学的平均分辨率2埃。它可以产生蛋白质和其它大分子两个或三个维度的图像，这是其他方法无法实现的。

　　冷冻电镜生产商FEI公司的首席科学家Jeffrey Lengyel表示，冷冻电镜让人激动的一点是，你可以启动一个生化反应，然后把处于各个状态的样本冷冻起来。这样，你可以确定多个构象的结构。

　　研究人员还可利用冷冻电镜图像，分析分子的运动。在加拿大多伦多儿童医院（Hospital for Sick Children）的John Rubinstein于2015年5月发表了一项成果。他把10万张冷冻电镜图像做成视频，展示了真核V-ATP酶（细胞膜上转运蛋白的酶）结构随时间的变化。在今年早些时候发表的论文中，Nogales等人利用冷冻电镜与同源模型，揭示了TFIID（一个大的、马蹄形的、启动基因转录的蛋白复合体）的结构。

　　一点点进步

　　Nogales等人使用的混合策略达到了10埃的整体分辨率，相比于以往分析TFIID的30埃分辨率是非常大的进步。分辨率的提高意味着科学家们能探索更多的问题：正如Nogales所说，“我们可以看到氨基酸与DNA相互作用。”

　　但冷冻电镜要求标本被冰冻。这是不理想的生物样品，因为冷冻的样本远远脱离了自身动态、天然的状态。核磁共振光谱（NMR）可以帮忙解决这个问题。Schr？der表示，核磁共振有一个很大的优势--可以得到蛋白在正常状态下的动态信息。他的实验室通过整合NMR、冷冻电镜和晶体学数据，得到分子模型。

　　NMR于20世纪40年代被首次应用到实验中。研究人员通过在外加磁场中激发原子得到大分子结构。当原子回到静息状态时，它们内部磁场的变化可以被检测到，从而反映出分子的原子结构。然而，核磁共振光谱只适用于相对较小的大分子或复合体。

　　结构生物学家也使用混合方法来解析超大复合体--这是过去无法完成的任务。Kornberg最新的成果（尚未发表）进一步拓展了他对RNA聚合酶II的研究，并使用混合方法描述了一个由50多个蛋白质和转录因子组成的巨大复合体。他表示，通过多个方法的结合，他们首次看到了整个复合体。每个方法都做出了同样大的贡献。

　　另一个超大型的目标是核孔复合体。这个膜蛋白复合体负责控制细胞核信息和分子的通过。2015年，Ellenberg等人使用一种混合方法来研究这种大型复合体。在过去，研究人员用晶体法和电子显微镜研究它，但他们无法获得整个复合体的分子分辨率图像，其整体结构在很大程度上仍然是一个谜。

　　Ellenberg的团队第一次利用超高分辨率荧光显微镜对核孔复合体进行了成像。他指出，超分辨率荧光显微镜的分辨率可以达到30纳米。为了提高分辨率，他们使用了一种名为单粒子平均的图像处理技术，把分辨率提升到了10埃。冷冻电镜的实验证实了他们的结果。他们得到了核孔复合体的结构图像。Nogales评价说，这样的模型在以前是无法想象的。

　　同样，多伦多大学（University of Toronto）的Rubinstein和Lewis Kay使用了混合方法打破了一些不可能。通过冷冻电镜和核磁共振光谱的结合，他们解析了VAT酶（一种在降解蛋白中发挥重要作用的酶）的构象变化。他们通过借助冷冻电镜解释结构，以及核磁共振揭示动态变化，二者结合，完美展示了VAT酶工作时的情景。

　　仍有缺点

　　虽然混合方法能带来更多的信息，但混合也会造成错误的叠加。因此，混合方法一个潜在的问题是，多个错误来源造成的误差增加。正如Meiler所说，结构生物学家关注的一个核心问题是，如何在整合方法的同时，减小误差，保证得到的模型具有准确性、精度和可靠性。

　　另一个障碍是多类数据集的共享和利用。任何一个技术都能得到丰富的信息，因此信息的共享非常麻烦。

　　Lengyel表示，每天都能生成百万兆字节的数据。他希望，结构生物学领域可以向高通量的遗传生物学领域学习处理数据超载的方法。虽然有能灵活地结合高分辨率晶体结构数据和冷冻电镜图的软件，但其它方法得到的数据无法简单地混合。例如，电子顺磁共振光谱测量高分子的距离和方向，而冷冻电镜产生密度图。虽然这两种数据结合在一起非常有用，但这两种数据语言并不相同。Meiler提出疑问，这些数据如何整合？如何分享？

　　为了探讨数据组织、共享和使用的最佳方式，几十名结构生物学家于2014年10月齐聚英国欧洲生物信息研究所（European Bioinformatics Institute）。该会议由全球蛋白数据银行（Worldwide Protein Data Bank）组织，是首个此类会议。

　　Schroder表示，目前，PDB存储单个蛋白结构的数据。他认为，PDB应该增加蛋白各个构象的数据。细节越丰富，越有助于全面解析蛋白和大分子功能。

　　学界已经做出了一些努力：目前已建立二维电子显微镜模型的档案库（Electron Microscopy Pilot Image Archive）和三维（EMDataBank）。这些档案库由EMBL等机构提供资金，其中包含的数据可以共享、归档和分发。

　　另一个可能阻碍该领域的威胁是专业知识。Meiler指出，技术需要投资，但投资在教育科学家上也非常重要。他建议，结构生物学领域的学生都去学习每一种方法的优缺点，并至少精通一种方法。他还表示，我们需要培养新一代的科学家，这些科学家需要理解如何整合这些不同的技术。

　　最后，结构生物学家必须学会提问题，提新的、复杂的、以前被认为不可能的生物问题。Ellenberg还表示，有了混合方法，很多5年前他甚至以为直到他退休都没法探索的问题都可以解决了。