探索神秘的微生物群落

　　2016年09月03日讯 微生物虽然看不见，但却是无处不在的。人体的肠道和皮肤、地球的海洋和土壤，甚至植物的叶片和种子，都有它们的身影。在大多数情况下，这些微生物群落是由许多不同的物种组成的。研究人员试图鉴定这些微生物群落的组成，但相当有难度。Sarah Webb在这一期的《BioTechniques》上介绍了目前的进展。

　　如今，新一代测序（NGS）、质谱（MS）和显微镜等技术正帮助多个领域的科学家慢慢了解各种微生物群落的基本组成和行为。大部分的工作集中在结构与功能的基本关系，比如控制生物膜行为的那些。

　　生物膜（Biofilm）是通过附着而固定在特定载体上的微生物群落。在这些群落中，细菌扮演着不同的角色，因为它们经历了不同的化学和物理环境。宾汉姆顿大学的Karin Sauer正应用各种分子遗传学技术来研究生物膜的形成，并利用蛋白质组学和转录组学技术来寻找一些基因，比如耐受抗生素的基因。

　　化学成分

　　哥伦比亚大学的微生物学家Lars Dietrich表示：“我们知道生物膜释放了许多代谢产物，一些是信号分子，一些是营养成分。不过，它们在生物膜中究竟如何分布？这很难观察。”为了了解生物膜中的化学信号，人们需要精确定位和分析化学物质的空间分布。

　　一些研究人员使用质谱来确定生物膜内的化学图像。加州大学圣地亚哥分校的Pieter Dorrestein就是在微生物系统中使用成像质谱（IMS）的先驱之一。在IMS中，研究人员对生物膜表面进行光栅成像，收集化学数据，并组装成二维图像。Dorrestein利用这种技术来研究微生物之间的相互作用。

　　尽管IMS技术很强大，也相对通用，但它也有一些缺点。这种方法需要样品制备，也是一种破坏性的技术，因此，即使IMS能够给出生物膜的详细快照，但它不能用于长期的追踪。基于这个理由，研究人员还在开发其他的工具。

　　氧化还原电位

　　哥伦比亚大学的生物学家和工程师已经开发出另一种工具：电化学芯片。微生物学家Lars Dietrich在研究铜绿假单胞菌，他对化学和细胞形态学之间的关联特别感兴趣。之前的研究表明，吩嗪这种氧化还原小分子可作为分子通气管，促进氧气在生物膜中的运动。尽管IMS能够提供一些信息，但Dietrich希望确定吩嗪是处于氧化状态还是还原状态。

　　为了解决这个问题，Dietrich与工程师Ken Shepard联手。他们开发出一种芯片，可测定表面的氧化还原电位。这种64 mm2的芯片上由1800个电极，每3分钟可测量一次。在最近一篇发表于PNAS的文章中，他们利用此芯片来追踪氧化还原吩嗪的运输。

　　单分子显微镜

　　荧光显微镜也被广泛用于生物膜结构的研究，通常是利用荧光报告基团的染色来跟踪感兴趣基因的表达。最近，普林斯顿大学的Bonnie Bassler小组向前迈进了一步。他们以单细胞分辨率来研究霍乱弧菌的生物膜。

　　尽管使用旋转盘共聚焦显微镜来减少光漂白，但研究小组需要对光束路径进行调整，以改善z轴的深度分辨率，让他们达到35 μm的深度，这与之前的显微镜方法相比增加了10倍。最终，他们能够完整描述霍乱弧菌生物膜形成的四个阶段。

　　测序及多组学分析

　　观察生物膜的形成是一件事，但研究人员也希望了解这些细菌群落中的基因和蛋白质。毫无疑问，NGS也是研究微生物群落的一种有力工具。Pacific Northwest国家实验室的Janet Jansson认为，实验技术已经大大改善，特别是测序。“如今测序不是瓶颈，数据解释才是，”她说。

　　Jansson的研究小组开发出一种方法，用土壤的片段化DNA序列来组装微生物基因组。为了改善组装，他们使用了Illumina的Moleculo这种长读取技术，这让他们能够获得数千个超过10 kb的contig序列。这些序列可作为支架，来组装更小但更高分辨率的片段。在最近的一篇文章中，研究小组获得了数百个基因组，它们代表了无法培养的微生物。

　　当然，DNA只能说出一部分的故事。随着研究人员试图了解功能，他们将宏基因组学与传统的功能分析结合起来，以了解感兴趣的活性。此外，宏转录组学则是宏基因组学的自然扩展，可提供微生物基因表达的信息。在同一项研究中，Jansson及其同事利用宏转录组学来查看哪些微生物是活跃的。

　　宏蛋白质组学和代谢组学则是评估生物膜功能的另外两种技术。不过，缺乏参考数据让实验有点复杂；基因、蛋白和代谢物的数据库这么少，使得人们很难做出有意义的评估。眼下，宏蛋白质组学只能评估土壤样品中的几千个蛋白。不过情况正在慢慢改善，人们对微生物群落的了解也在慢慢加深。