那些中国学者发表的重要冷冻电镜研究发现

　　2016年09月20日讯 冷冻电子显微技术（cryo-electron microscopy, cryo-EM）在结构生物学领域发挥了越来越重要的作用。早在七八年前，清华大学就开始重视冷冻电镜技术，投入了大量资金用于冷冻电镜设施的建设。这个决定使清华在冷冻电镜领域，无论是从科研设备还是人才成果等方面都跻身世界领先水平。

　　近期来自清华大学生科院的施一公教授发表综述：“Biological cryo-electron microscopy in China”，回顾了冷冻电镜在中国的发展历史，描述了目前的发展状态，并展望了这种技术将会为生物学研究的各个领域带来什么样的影响。

　　在这篇文章中，施一公教授介绍了十多项近年来中国学者在电子显微，冷冻电镜上的重要成果，那么首先什么是冷冻电镜呢？

　　在此前施教授的演讲中他曾提到，冷冻电镜就是把电子打在样品上，经过傅里叶变换，最后收集图象，进行particle classification（粒子分类），最后重构出一个三维的结构。样品是动态的，把样品放在一个格栅上面，最后把它弄得很薄，然后冷冻，不同的方向都会被保存下来，这样透射电镜透射以后这个投影会出现不同的图像，然后通过三维的重构把原始图像放在一起。

　　一直以来，研究蛋白质结构有三种主要方法：X射线晶体衍射、核磁共振以及单颗粒冷冻电子显微镜（冷冻电镜）。其中冷冻电镜异军突起如此之迅猛，2015年也成为Nature杂志评选的年度技术（Method of the Year），这两年的革命性进展，一是它的照相机技术，二是其软件分析的图像处理技术，尤其是前者的进步大幅提高了冷冻电镜的解析能力。另外几前该领域出现了一项新技术突破：“直接电子检测装置”。这个装置可以让分辨率大大提高，为这项技术的应用起到了至关重要的作用。

　　染色质结构

　　大小为30nm的染色质纤维结构的组织构架与动态机制都在基因转录调控中扮演了重要的角色，中科院生物物理研究所的朱平研究员曾于1999年在佛罗里达州大学从事冷冻电镜的博士后研究工作，他一直致力于艾滋病病毒AIDS包膜糖蛋白ENV的研究，曾作为第一作者在Nature上发文，利用冷冻电镜详细描述了AIDS病毒表面上的蛋白刺，这些蛋白刺可让该病毒非常有效地与人体免疫细胞结合和融合。每个病毒体在每个粒子上平均有14个刺，其中的一些刺是聚集在一起的，这个特点与病毒组装、感染及中和机制都有关系。

　　去年，其研究组在Science上发文，首次解析了30nm的高分辨率三维结构并提出了一种全新的染色质纤维结构模型。

　　在研究者“看”到的染色质结构中，DNA上每两个相邻的核小体通过中间连接的DNA“相对而望”，顺着左手螺旋的方向让DNA丝沿“Z”型路线往上堆叠，形成直径30nm的染色质丝--相邻核小体间并没有H1组蛋白的相互作用，但H1组蛋白在整个结构的堆叠模式上起了很大的作用。这个结构有力地印证了之前许多相关的实验现象，与核小体的晶体结构也有很高的一致性。不仅如此，这份3D“照片”推翻了之前科学界推测的模型：在这之前，科学家们普遍假设这段结构是6个核小体围成的“玫瑰花结”往复堆叠；而这项研究证实，真实结构是每四个核小体为单位的左手螺旋。中国学者独家发表Science文章解析染色质

　　免疫应答受体

　　自1989年Charles Janeway在冷泉港会议上提出模式识别受体假说以来，在高等动物中迄今已经发现了三大家族的模式识别受体，分别是Toll-样受体（TLR）、视黄酸诱导基因-样受体（RLR）和Nod受体（NLR）。其中NLR是一种具有识别入侵病原体和激活先天免疫反应重要功能的胞内模式识别受体。

　　清华大学生命科学学院的柴继杰教授一直以来都对哺乳动物免疫监控系统中的这些受体十分感兴趣，2013年，他在Science杂志上发表文章，首次报道了小鼠NOD样受体NLRC4自抑制状态的晶体结构，并通过结构分析和生化实验揭示了该蛋白维持自抑制作用的分子机制，这也是NOD样受体家族中第一个被解析出的近乎全长的蛋白质晶体结构。

　　膜内蛋白酶与γ-分泌酶

　　施一公教授自2005年开始就一直从事膜内蛋白酶的研究，他曾利用X射线晶体技术解决了丝氨酸蛋白酶与锌金属蛋白酶的结构难题，其终极目标是γ-分泌酶，人体来源的γ-分泌酶与多种疾病有关，如阿兹海默症。

　　2012年，清华大学的研究人员在Nature杂志上报告了一个presenilin/SPP家族膜内天冬氨酸蛋白酶的晶体结构（清华施一公最新Nature文章 ）。2014年7月，揭示出了人类γ-分泌酶的三维结构，该研究对于深入了解γ-分泌酶的功能机制，开发出预防及治疗阿尔茨海默氏症及某些类型的癌症的新型γ-分泌酶抑制剂具有重要的意义。

　　2014年9月，施一公研究小组揭示出了γ-分泌酶组件nicastrin的晶体结构，这为理解γ-分泌酶的组装及工作机制，以及阿尔茨海默氏症的发病机理提供了重要线索。

　　2015年8月，施一公课题组与剑桥生物医学院的研究人员合作，他们采用单颗粒冷冻电子显微镜首次获得了完整人类γ-分泌酶（γ-secretase）的原子结构，研究结果发布Nature杂志上。这项研究为更深入地了解γ-分泌酶的功能机制奠定了分子基础，对于开发出预防及治疗阿尔茨海默氏症的新型γ-分泌酶抑制剂具有重要的意义。

　　离子通道

　　清华大学的颜宁教授希望能解开骨骼肌与心肌中Na+和Ca2+离子通道的结构谜题，2012年其研究组发表文章，解析了电压门控钠离子通道NavRh的三维晶体结构，首次从结构的角度报道了抑制离子钙离子在电压门控钠离子通道的结合位点，也是首次获得处于灭活构象的电压门控离子通道。这项工作不但为真核电压门控钠离子通道功能的进一步研究提供了有力的结构依据，而且为该领域存在的重大争议问题提供了结构线索。此外，相对高性价比的纯化和结晶方法，使得NavRh可以用来进行以结构为基础的药物设计和药物筛选。

　　此后，在此技术上，颜教授研究组又在Science上发文，首次报道了真核生物电压门控钙离子通道的4.2埃分辨率的冷冻电镜结构。

　　他们利用单颗粒冷冻电镜方法，重构出了分辨率为4.2埃的兔源Cav1.1蛋白复合物的三维结构，首次展示了Cav1.1各个亚基的相互作用界面和亚基内部结构域的分布情况，揭示了各个辅助亚基（a2d，b，g）调控离子通道亚基（a1）的分子机理，为理解真核Cav和Nav的功能以及它们与疾病相关的机制提供了重要的结构基础。

　　今年颜教授研究组在Nature上发表的文章在3.6??的标称分辨率上，解析了兔Cav1.1复合物的冷冻电子显微镜结构，报道了首个真核电压门控钙离子通道的近原子分辨率三维结构。

　　光合作用

　　植物光合作用由一系列光驱动，叶绿体膜上的多个超分子过程组合完成，其中绿色植物光系统II（PSII）的主要捕光复合物LHC-II是植物光合作用中主要的太阳能收集器，它负责吸收光能并将能量进一步传递给光反应中心。

　　2004年，中科院生物物理所，植物所合作报道了菠菜主要捕光复合物 （LHC-II） 2.72 ?分辨率的晶体结构，研究人员发现了膜蛋白结晶的一种全新方式，并首次报导了二十面体状的膜蛋白-脂质体复合物的空心球体的结构。在这一结构中，他们测定了包括蛋白质分子、色素分子、脂分子和水分子在内的近三万个独立原子的高精度三维坐标数据。结构研究结果揭示了色素分子在LHC-II中的排布规律，建立了该复合体内完整的能量传递网络，并提出了一个基于结构的光保护分子机理的模型。

　　时隔几十年，当年参与研究的研究生柳振峰与常文瑞已经在各自的领域取得了重要成果，今年前者在Nature上发文，报道了菠菜光系统II（Photosystem II）-捕光色素复合物（LHC-II）超级复合体的结构，分辨率为3.2埃。