南开大学:“自杀式”CRISPR/Cas9系统

　　2016年08月28日讯 来自南开大学和北京师范大学的研究人员，在Nature子刊《Scientific Reports》发表题为“A ‘suicide’ CRISPR-Cas9 system to promote gene deletion and restoration by electroporation in Cryptococcus neoformans”的研究论文。这项研究提出了一种“自杀式” CRISPR-Cas9系统，使我们能够通过后续的互补作用，验证基因的功能，并有可能减少脱靶效应。因此，这项技术适用于新型隐球菌的功能基因组学研究。

　　作为原核生物的一种适应性免疫机制，集群定期间隔短回文重复（CRISPR）和CRISPR相关（CRISPER-Cas）系统，使宿主能够防御噬菌体和其他可移动的元素和载体。CRISPR-Cas9系统在基因组编辑中的效力广受好评，特别是难以进行遗传操纵的生物体。为了构建这一系统，需要两个基本组成部分：一个单一的嵌合引导性RNA（gRNA）成分，是通过将约20nt的靶序列RNA（crRNA）与一段订制的细菌tracrRNA、以及细菌Cas9内切酶的一个蛋白质成分融合而产生的。

　　这一系统通常被转化到宿主细胞以进行功能表达。用以gRNA和Cas9核酸酶生产的表达组件将在很大程度上持续存在于宿主中--甚至在编辑过程完成后，作为异位整合副本或自由复制的DNA分子（minichromosomes）。因此，这种方法有其固有的缺陷，如Cas9内切酶的潜在毒性和伴随细胞增殖而积累的靶基因突变。触发不良遗传学变化的CRISPR-Cas9系统通常出现脱靶效用，在某些生物中CRISPR-Cas9是有细胞毒性的，包括酿酒酵母和裂殖酵母。

　　科学家在研究中遇到的另一个实际问题是，CRISPR-Cas9系统在细胞中的持久性，会阻止新生隐球菌（C. neoformans）中突变基因的修复，因为该系统也靶定包含相同gRNA靶序列的互补基因。这种局限性代表了一个重要的问题，在编辑系统的实际应用中必须解决，因为CRISPR-Cas9表达组件的体内存在，并不适于许多的应用（例如，生物医学和农业）。即使是在微生物的实验室研究中，剩余的CRISPR-Cas9 DNA也会降低该系统作为基因组操纵工具的有利度。

　　担子菌酵母新型隐球菌（C. neoformans）作为艾滋病相关真菌病和其他基本生物问题的一种模型，已经得以广泛的研究，并存在低的同源重组频率，特别是D型菌株。目前已经开发出来两种不同的转化系统--基因枪转化和电穿孔转化，通过同源重组破坏许多基因。然而，这些方法实现的同源重组频率，在A型和D型菌株之间有着显著的差异。基因枪转化是一种昂贵的程序，可以通过同源重组实现A型菌株的基因破坏，频率在2%和50%之间，而D型菌株系列的频率在1%和4%之间。

　　此外，在D型菌株中，电穿孔转化可引起1/1000到1/100,000的同源重组频率。其他基因组编辑技术，例如锌指核酸酶或TAL效应物核酸酶（TALENS），在这种菌一直没有相关报道。因此，构建一个功能性CRISPR-Cas9系统来进行靶向基因删除和基因重组，用于酵母的毒性研究，有着重要的意义。

　　在这项研究中，研究人员报道了一种自发消除CRISPR-Cas9系统的方法，而不会影响其强大的编辑功能。该研究小组在一种内源性U6启动子和人密码子优化的Cas9内切酶的驱动下，成功地表达了单个引导RNA。该系统可在酵母中有效地生成一个插入缺失突变，并通过电穿孔法，经由同源同源性修复，有效地进行靶向基因中断。

　　然后，该研究小组通过CRISPR-Cas9表达组件到重组构建的顺式排列，证明了该系统的自发消除。在系统介导的双交换之后，CRISPR-Cas9组件被裂解和降解，这可通过Southern blotting得以验证。这种“自杀式” CRISPR-Cas9系统，使我们能够通过后续的互补作用，来验证基因的功能，并有可能减少脱靶效应。因此，这项技术有潜力用于新型隐球菌的功能基因组学研究。