CRISPR 基因编辑技术及张锋的贡献

　　2016年09月14日讯 地球上所有细胞生物的遗传信息都储存在数字化的DNA序列中。今天，基因测序技术已经非常发达，DNA序列可以非常廉价迅速的确定。但测序只是读取数据，近年生物学最大的发现与发明之一是可编程的基因编辑技术：CRISPR-Cas9。这个技术类似于 WORD的搜索替换功能：用户输入一串字符串，程序找到匹配的字符串，然后进行删除或者替换。CRISPR-Cas9 的编辑技术里，搜索匹配字符串由实验人员通过一段 RNA表示，叫做导引 RNA -- gRNA，编辑由一个称为 Cas9 的蛋白根据 gRNA 定位完成。这个编辑系统的灵活性显而易见。Cas9 蛋白是固定的，你只需要改变导引就能在不同位置对DNA进行编辑。

　　CRISPR-Cas9 技术的来源是细菌的自然免疫系统。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。有的细菌的CRISPR系统很复杂，涉及多种 Cas 蛋白 （Cas 的意思是 CRISPR-associated -- 与CRISPR相联的 ）。经过多年的研究，生物学家们终于找到了一种简单的系统，只用到一种蛋白 -- Cas9。接下来，他们成功把这个细菌的系统进行改造用于动植物细胞的基因编辑。率先完成这一实际应用性开发的是张锋的研究小组。本文试图对相关技术与历史进行简单的介绍。

　　这里我把CRISPR之前漫长的研究历史一笔带过。简单而言，人们之前发现细菌免疫系统依靠一段很短的RNA进行识别，这段RNA称为 crRNA （CRISPR RNA）。可想而知，这段 crRNA 包含有入侵病毒的基因识别码。

　　CRISPR相关研究在2011年取得了重大突破。这一年，法国女科学家 Emmanuelle Charpentier 报告，通过基因分析与相关实验，发现一个只有四个组件的细菌免疫系统。除了 Csn1 蛋白（后来称为 Cas9）与 crRNA外，还发现一个他们称之为 trans-activating CRISPR RNA（简称 tracrRNA）的RNA。顾名思义，这个 tracrRNA 起到转写-启动的功能。第四个组件是一个作用于RNA的生成，称为 RNase III的蛋白。但这篇2011年的论文对各个组件的具体功能并没有完全确定。其论文中的下图显示 ：蓝色是 Cas9 蛋白，红色的是 tracrRNA， 绿色+黑色线段是 crRNA （其中绿色部分对应需要识别的病毒编码），黄色是RNase III。

　　DOUDNA、Charpentier 联合小组通过在细胞体外的试管实验发现了负责DNA切割的充分并且必要的三个部分：Cas9， crRNA 与tracrRNA （不需要 RNase III）。论文还确定了三个部分的作用：其中Cas9 是切割机， crRNA 的主要作用是定位。而 tracrRNA 在与crRNA耦合后启动 Cas9 的切割功能（activate）。他们还成功把 crRNA 与tracrRNA 连起来成为一个分子，这样可以把 DNA 切割的组件由三个变成两个。如上图。左边是自然原核细菌中的机制，两个RNA分子。右边则是人工机制，把两个RNA给连起来了，成为一个带着一个配对圈的RNA分子。但 DOUDNA 等人的实验并没有在任何细胞内进行，只是在细胞体外的试管里，当然也没有在动植物等真核细胞内实验，也不知道能否可行（ “it was not known whether such a bacterial system [the CRISPR-Cas9 system] would function in eukaryotic cells.”） 。

　　现在我们知道，Charpentier 2011年的论文出来后，美国东部 BROAD研究院的张锋小组也展开了研究。在Doudna/Charpentier 2012年6月论文发表前半年，张锋在2012年1月向NIH申请了一个项目：运用Cas9系统对真核细胞进行基因编辑。

　　上图是一个哺乳动物 CRISPR 基因编辑系统的设计。其代码进行表达后会生成四个部分（1）带NLS的Cas9 蛋白，（2）tracrRNA ，（3）多个 crRNA -- 注意不同颜色的线段 （图中称为 guide RNA array），（4） 带NLS的RNase III。真核细胞的特点是遗传物质在细胞核内，一般较大的蛋白是进不去的。其中 的　NLS 是为了使 Cas9 等 生成后能够被拖入细胞核内。可以这么说，张锋的思路是先不管具体机制是什么，直接在高等生物上进行基因编辑实验，而且多点编辑同时进行。

　　张的小组在2013年1月发表论文，报告了他们的发现：（1）他们对四个组件进行了组合实验，发现基因编辑不需要 RNase III；（2）使用 Cas9 、crRNA 与 tracrRNA 组合，成功对真核细胞实现编辑，效率相当高（ indel 达19%）；（3）使用 DOUDNA 论文中的嵌合 RNA （chimera），发现长的那个（chimera A ）编辑效率较双RNA系统低 （最高5.6%， 部分无法探测），短的那个 （chimera B） 不能编辑。