基因组编辑技术CRISPR/Cas9的重大发现

　　2016年08月31日讯 基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

　　中国科学家将进行世界首个人类CRISPR基因编辑临床试验

　　如今，中国科学家即将利用CRISPR-Cas9基因编辑技术将修饰后的细胞注入人体进行人类临床试验，这将是世界上首个在人类机体中进行的CRISPR试验。

　　进行这项研究的是来自四川大学华西医院（West China Hospital）的研究者Lu You（卢铀），他计划下个月在肺癌患者机体中检测利用CRISPR-Cas9修饰后的细胞的性能，这项临床试验已于7月6日获得了医院伦理审查委员会的批准审核。研究者卢铀，毕业于华西医科大学，长期从事肺癌和食管癌等胸部肿瘤放化疗和分子靶向治疗的临床与基础研究，肿瘤综合治疗及抗肿瘤新药临床试验研究。

　　这项在中国进行的人类临床试验将会招募转移性的非小细胞肺癌患者和化疗、放疗及其它疗法相继失败的肺癌患者，研究者Lu表示，目前针对癌症的疗法选择非常有限，而基于CRISPR的技术或将为多种疾病的患者带来光明，尤其是那些每天需要治疗的癌症患者。

　　研究者Lu的研究团队将从招募的患者机体提取免疫细胞-T细胞，随后利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除细胞中的特殊基因，该基因所编码的蛋白PD-1可以扮演细胞检查点的角色，其可以对细胞发起的特殊免疫反应进行检查，从而抑制健康细胞被攻击。CRISPR-Cas9技术可以同分子向导配对来识别出携带特殊酶类的染色体上的特殊遗传序列。

　　随后研究者在实验室中扩增被基因编辑的细胞，并将这些修饰后的细胞重新注入到患者的血液中，这些工程化的细胞就可以在患者机体中进行循环并且“游入”癌症组织中；即将在美国进行的临床试验也利用了类似的方法来敲除编码PD-1的基因，同时研究者还计划敲除第二个基因，并在细胞重新注入患者体内之前插入第三个基因。

　　最后研究者Lu说道，我希望我们是第一个进行这项临床试验的人，更重要的是，我们希望可以通过这项临床试验获得足够多的积极性证据。

　　科学家质疑巨病毒存在类似CRISPR/Cas的系统

　　在很多细菌中发现的CRISPR/Cas免疫防御系统，因其能够简单地而又优雅地编辑宿主基因组，而成为时下最火热的生物技术，在近期产生一大批发现。在今年3月，来自法国艾克斯-马赛大学的Didier Raoult和同事们发表一篇论文，指出一种被称作mimivirus的巨病毒（giant virus）拥有一种类似于CRISPR系统的被称作mimivirus噬病毒体抵抗元件（mimivirus virophage resistance element, MIMIVIRE）的噬病毒体抵抗机制（Nature, 10 March 2016, doi:10.1038/nature17146）。而在上个月发表在Virologica Sinica期刊上的一篇论文中，来自法国国家科学研究院（CNRS）的Jean-Michel Claverie和Chantal Abergel对这种观点提出挑战。

　　Claverie和Abergel在他们的论文中写道，“MIMIVIRE并不类似于CRISPR-Cas系统，并不能够作为一种核酸识别系统发挥作用，也不可能拥有一种真正的适应性免疫系统所拥有的所有性质。”

　　Claverie和Abergel继续质疑这种噬病毒体抵抗机制到底是不是基于核酸的。他们提出蛋白可能干扰这种抵抗噬病毒体的mimivirus中的噬病毒体复制。

　　但是，Claverie和Abergel声称这种mimivirus防御机制一点都不像CRISPR系统。首先，mimivirus基因组和噬病毒体复制发生在相同的地方，“这就不可能获得基于核酸的免疫系统”。再者，CRISPR代表着规律间隔性成簇短回文重复序列，而MIMIVIRE序列“并不是规律间隔性的，而且在两侧也不存在可识别的重复序列”。最后，与MIMIVIRE序列相对应的Zamilon序列缺乏被称作前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif, PAM）的序列，其中细菌宿主通常利用这一序列区分病原体DNA和它们自己的DNA。

　　利用CRISPR/Cas9让沉默基因不再沉默

　　CRIPSR/Cas9是细菌天然地用来抵抗病毒感染的一种免疫系统。它允许科学家们在基因组靶位点上精确地导入、移除或替换特异性的DNA片段。迄今为止，CRISPR/Cas9是最为高效的、廉价的和最容易操作的基因编辑工具。然而，科学家们在此之前还不能够高效地利用它激活细胞中的基因。

　　在一项新的研究中，来自日本北海道大学遗传医学研究所的Toru Kondo团队利用CRISPR/Cas9系统开发出一种强大的方法做到这一点。相关研究结果发表在2016年5月23日那期Angewandte Chemie期刊上，论文标题为“A Powerful CRISPR/Cas9-Based Method for Targeted Transcriptional Activation”。

　　细胞中的基因拥有它们自己的开关：启动子。当基因的启动子发生甲基化时，该基因就被关闭，或者被沉默。

　　在这项新的研究中，研究人员想要高效地激活沉默基因（即因启动子发生甲基化被关闭的基因，也就是不发生转录的基因）。他们将一种被称作微同源末端连接（microhomology-mediated end-joining, MMEJ）的DNA修复机制与CRISPR/Cas9组合使用。他们利用CRISPR/Cas9切掉发生甲基化的启动子，然后利用MMEJ插入一个未发生甲基化的启动子，也就是利用基因的开启开关替换它的关闭开关。

　　研究人员在神经细胞基因OLIG2和胚胎干细胞基因NANOG上使用了这种工具以便测试它在体外培养的细胞中的效率。在5天内，他们发现证据证实这些基因强效地表达。在当体外培养的人胚胎干细胞中利用这种方法激活OLIG2基因时，它们在7天内高效地分化为神经元。

　　研究人员也发现他们的基因编辑工具可能能够被用来激活其他的发生沉默的启动子。此外，他们发现这一系统并不会导致细胞中其他的非靶向基因发生不想要的突变。这种工具有巨大的潜力被用来操作基因表达，构建基因电路，或者改变细胞命运。

　　利用CRISPR/Cas9有望靶向清除多种疱疹病毒感染

　　大多数成年人携带着多种疱疹病毒。在初始的急性感染后，这些病毒在它们的宿主体内建立终生感染，并导致唇疱疹、角膜炎、生殖器疱疹、带状疱疹、传染性单核细胞增多症和其他疾病。一些疱疹病毒还能够导致人们患上癌症。在潜伏性感染阶段，这些病毒长时间地保持潜伏状态，但是保持偶尔重新激活的能力。这种重新激活有可能导致人们患病。一项新的研究提示着利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术攻击疱疹病毒DNA能够抑制病毒复制，而且在一些情形下，能够导致病毒清除。相关研究结果于2016年6月30日发表在PLoS Pathogens期刊上，论文标题为“CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing of Herpesviruses Limits Productive and Latent Infections”。

　　在这项新的研究中，来自荷兰乌德勒支大学医学中心的Robert Jan Lebbink和同事们认为应当能够靶向作用于被感染的人细胞中的潜伏性疱疹病毒DNA并让它们的DNA发生突变，因而潜在地阻止疱疹病毒相关的疾病。为了测试这一点，他们设计出特异性的向导RNA（gRNA），即与疱疹病毒基因组的关键部分互补的且发挥着分子地址作用的短RNA片段。这些gRNA当与CRISPR/Cas9系统中发挥着分子剪刀作用的Cas9结合在一起时，应当能够诱导在疱疹病毒DNA的特定位点上发生切割，随后诱导它们的DNA发生突变，从而破坏这些病毒。

　　通过采取这种方法，研究人员研究了三种不同的疱疹病毒成员：导致唇疱疹和疱疹性角膜炎的1型单纯疱疹病毒（HSV-1）；人巨细胞病毒（HCMV），最为常见的病毒性出生缺陷病因（当这种病毒由妈妈传播给胎儿时）；导致传染性单核细胞增多症和多种癌症类型的爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus, EBV, 也被称作EB病毒）。

　　研究人员总结道，“我们观察到将EBV从被潜伏感染的肿瘤细胞中高度有效地和特异性地清除出来，以及破坏HSV-1和HCMV在人细胞中的复制。”他们继续说道，“尽管CRISPR/Cas9并不能够高效地对潜伏性HSV-1进行基因组编辑，但是一旦潜伏性HSV-1重新激活，利用HSV-1特异性的gRNA能够高效地阻止HSV-1复制。”他们希望，他们的结果“可能允许设计出高效的治疗策略靶向潜伏性感染和增殖性感染期间的人疱疹病毒。”