骨髓移植嵌合染色体 骨髓移染色植后性体的嵌合度

一、骨髓移植的原理

　　容性复合物(MHC)被发现的，其基因编码所表达的抗原，参予控制免疫识别及细胞亚群间相互作用，故HLA不相匹配对移植物与受者组织之间的相互排斥有影响。临床上一方面可产生移植物不能植活，另一方面可产生轻重不等的急性与慢性移植物抗宿主病，表现为皮肤、肝脏和胃肠道病变，严重者可导致死亡。因此，HLA的组织配型对供髓者的选择和骨髓移植的成功与否，是重要环节之一。

　　约60%的成人急性白血病患者，经过异基因或同基因骨髓移植可达 年以上长生存期，部分已达5～6年以上。在慢性粒细胞白血病慢性期，约80%的病人可存活3年以上，部分已存活5～6年以上，可谓根治。有人比较了只用常规联合化学治疗，不做骨髓移植的急性白血病，仅有10～15%的人存活到3年，平均生存期仅一年左右。慢性粒细胞白血病的生存期平均3～4年，病程虽缓慢，但用目前化疗方法无根治的可能。因此，骨髓移植所取得的疗效较常规化疗为佳。对淋巴瘤及其他实体瘤应用自体骨髓移植亦可达到根治的目的。

　　一类为异基因骨髓移植(1970年代以来临床应用 已取得很大的成功)。它需有与患者人类白细胞抗原 (HLA)相匹配的同胞兄弟 姐妹以及极少数的无亲缘关系的供髓者所输入的异体骨髓，或家庭成员间如父母和子女的骨髓移植;以及与患者HLA不很匹配的无关供者的骨髓。非同胞的兄弟姐妹虽HLA相匹配，但易发生轻重不等的移植物抗宿主病(GVHD)，尤其在后一种情况更严重。另一类为同基因骨髓移植，即极少数的同卵双胎孪生兄弟或姐妹间的骨髓移植。还有一类为自体骨髓移植(ABMT)。此类骨髓移植开展较晚，80年代应用于临床。用自身的骨髓，不需供髓者，此法简便，易于推广，可用于独生子女，并且无GVHD的发生。用于白血病，淋巴瘤和多种实体瘤的治疗。

　　人类白细胞抗原 (HLA)基因位点同时存在于两条第 号染色体的短臂上，每条上又由紧密连锁的复杂的基因位点组成。每个位点都由几个或几十个等位基因中的一个组成。在细胞膜上，目前所发现的抗原已有200种左右。在实验室目前所能检测到的HLA抗原只有HLA-A、-B、-C、-D/DR 这几大类。实验室所测得两人之间这几种抗原相符合，不等于两人的全部抗原中没有不相符之处。在同胞兄弟、姐妹中从父母各接受一条染色体上每种基因的一个，所以是单倍体基因遗传。同胞兄弟姐妹间基因配合方式完全相同率仅占25%，父母与子代间总有一个单一型染色体上HLA的A、B等位点的配合不同，故除同卵的孪生兄弟或姐妹外，家庭成员间及无关供者间HLA相匹配的机率是极少的。

二、骨髓移植的影响体内嵌合状态形成的因素

　　影响嵌合状态形成的因素有多种,包括移植方式的选择,对移植物处理方式的不同,预处理方案的差异,患者移植时所处的状态等。这些因素的内在原因可能是:

　　输入干细胞量的不等

　　临床研究显示,PBSCT后患者中性粒细胞和血小板的恢复都显著快于BMT患者。这是由于在异基因PBSCT时,受者体内输入了大量的造血祖细胞和造血干细胞。外周血中大量的供者干细胞可促进供者细胞的生长,增加了供者细胞的比例,从而影

　　响嵌合状态的检测情况。Briones等在进行T细胞清除性移植的嵌合监测中发现,在移植后1个月时,选择性应用富集CD34+细胞的PBSCT患者,与行BMT的患者相比很少发生混合嵌合状态,而以完全的供者嵌合状态为主。然而,Nakao等观察到,部分患者在移植方式不同的情况下,即使输入的干细胞量相同,嵌合状态的检测结果也不同,表明还有其他因素影响PBSCT后供者细胞的植入。

　　输入的供者T细胞与受者T细胞的量

　　一般认为,供者的功能性T细胞能够清除受者的T细胞,从而保持供者细胞的持续植入和供者造血干细胞的增殖,PBSCT患者早期的完全嵌合状态比例高于BMT患者的原因也在于此。在异基因PBSCT(allo2PBSCT)时,输入了比异基因BMT(allo2BMT)多10-20倍的T细胞,大量供者来源的T细胞可以清除剩余的受者T细胞和抗原呈递细胞,从而加速完全嵌合状态的建立。Chabannon等对allo2PBSCT后T淋巴细胞系的分析结果证实了此假设。一些CML慢性期病例的研究结果显示,进行T细胞清除性BMT的病例,50%-100%呈现混合嵌合状态,未经相应处理的BMT患者混合嵌合状态约占20%,其余的呈现完全的供者嵌合状态。以上这些研究提示移植物中T细胞的作用,但是T细胞过多会发生移植物抗宿主病。

　　非清髓性移植在一定程度上反映了供者干细胞和T细胞在嵌合状态形成中的作用。以往认为,进行超大剂量的放、化疗以清除受者的自体细胞是供者血细胞植入的必要条件之一,如果细胞清除不彻底,可能导致植入失败等]应用的是弱强度的预处理方案,观察到三分之一的病人在移植后第8天呈现完全的嵌合状态,证明传统的清髓性移植并非建立完全嵌合状态所必需。这种非清髓性移植,也称小移植,国内外均有报道,其基础即是输入了大量供者来源的造血干细胞和T细胞。两种因素的共同作用促使供者细胞嵌合状态的形成。

　　其他原因

　　不同的预处理方案有可能影响形成完全的供者嵌合状态的比率,这可能主要是指预处理方案强度的不同。Nakao等[5]在对比含和不含全身照射的预处理方案对嵌合形成的影响时没有发现显著差异。移植后免疫抑制剂的应用也是影响因素之一。

三、骨髓移植后嵌合状态检测方法的分析

　　检测标本

　　移植前取供者和受者的外周血或骨髓,选择可供分析的某些基因多态性位点,移植后定期采取患者的骨髓或外周血做嵌合状态的分析。如果未采到受者移植前的标本,通常可以用组织DNA来代表移植前的基因状态,如口腔粘膜细胞,病理切片等。在一定条件下,漱口水标本检测可以用来代替移植前受者基因型的确定。但是,等[17]研究了骨髓移植后受者漱口水的指纹图谱,发现10例标本中8例呈现嵌合模式,其余2例则为供者的基因型。原因是在漱口水中75%为受者的上皮细胞,25%为供者的白细胞,以磁珠吸附法可以将上皮细胞粘附分离。同时发现,经过磁珠吸附后的细胞也可以呈现供、受者细胞的嵌合状态。他们认为磁珠不仅可以吸附上皮细胞,而且可吸附血细胞。

　　嵌合状态检测方法

　　近年来发展了一些嵌合状态的检测方法,其检测基础都是利用人群中所具有的多态性遗传标记,包括微卫星、染色体、红细胞抗原、HLA、限制性长度片段的多态性,可变数目串联重复序列(VNTR)与短串联重复(shorttandemrepeat,STR),还有其他特殊的具有多态性的DNA分子,较常用的是珐琅蛋白(amelogenin)基因片段、Y染色体特异的基因等。选择灵敏度高的方法对嵌合状态的检测非常重要,目前应用最广泛的是PCR法扩增微卫星序列。微卫星序列是分布于整个基因组上的呈高度多态性的串联重复序列。扩增这些区域可以区分供者或受者来源的细胞,主要是在以供者细胞为背景的情况下

　　来发现受者细胞。因此,在进行检测之前需要先选择对供受者有意义的位点。等[判断有意义位点的标准是,在分析微卫星的多态性位点时能显示供、受者各自的特异条带,或者至少受者有特异条带。如果受者是男性,供者是女性,还可用珐琅蛋白基因。X和Y染色体上均有该基因,但基因片段长度不同。

　　细胞遗传学方法通过分析性染色体判断植入,但需要进行细胞培养。PCR法不仅不需要进行细胞培养,应用的范围也不局限于性别不同的供、受者。红细胞抗原检测是一种灵敏且快速的方法但某些情况下,红细胞抗原的转换出现迟,在骨髓移植后4个月甚至更久,因此该方法在应用上受到了限制。DNA多态性标记RFLP分析需要大量未降解的DNA,程序也比较繁琐

　　PCR法突出的优点是灵敏度高,可达0.01%-5%,采用的方法不同灵敏度变化范围较大。其中灵敏度最高的是放射标记法,可达到0.01%-0.1%。Y染色体特异基因的扩增可以用于供、受者性别不同时。Nuckols等[21]利用市售的试剂盒同时扩增8个微卫星序列及珐琅蛋白分析了18例病人,在供、受者之间至少在1个以上的位点显示有独特的等位基因,大大加快了多态性位点的选择速度。定量方面等及Miflin等用荧光标记引物扩增的方法,Nuckols等[则用PCR结合毛细管电泳技术进行分析,这些定量方法的使用大大增强了嵌合状态检测的意义.

四、骨髓移植的临床意义

　　目的探讨异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopietic stem cell transplantation, allo-HSCT)后嵌合状态与微小残留病(minimal residual disease, MRD)和移植后白血病复发的关系.方法 57例白血病患者接受性别不同的供体HSCT,在移植后不同时期留取骨髓细胞,采用双色间期荧光原位杂交(interphase fluorescence in situ hybridization, I-FISH)技术对性染色体和bcr/abl融合基因进行监测,SPSS10.0统计软件分析嵌合状态与MRD和白血病复发的关系.

　　结果 I-FISH测定性染色体和bcr/abl融合基因敏感性高于常规核型分析;嵌合状态与MRD呈负相关(r=-0.9690,P<0.01);在移植早期(3个月)混合嵌合状态比完全嵌合状态患者复发率高,嵌合状态和MRD与白血病复发具有相关性(r=-8240,P<0.01; r=-9040,P<0.01);嵌合率下降出现在白血病血液学复发前.结论 I-FISH用于allo-HSCT后的MRD监测具有高特异性和敏感性,性染色体作为性别不同的allo-HSCT后MRD的监测其临床价值与肿瘤特异性基因标志相同,嵌合状态与MRD呈负相关,嵌合状态和MRD与移植后白血病复发相关,嵌合率的下降可作为移植后白血病复发的分子遗传学标志.