结核杆菌t细胞检测 结核杆菌生物学性状

一、结核杆菌生物学性状

　　1、形态染色

　　结核杆菌细长略弯曲，端极钝园，大小约1～4×0.4um ，呈单个或分枝状排列，有荚膜、无鞭毛、无芽胞。在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。结核杆菌一般常用齐-尼式钠氏(Ziehl-Neelsen)抗酸性染色法染色，结核杆菌染成红色，其他非抗酸性细菌及细胞浆质等呈蓝色。结核杆菌的抗酸性取决于胞壁内所含分枝菌酸残基和胞壁固有层的完整性有关。

　　2、培养特性

　　结核杆菌为专性需氧菌。营养要求高，在含有蛋黄、马钤薯、甘油和天门冬素等的罗氏固体培养基上才能生长。最适ph 6.5～6.8 ，最适温度为37℃，生长缓慢，接种后培养3～4周才出现肉眼可见的“菜花样”菌落。菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒状、乳酪色或黄色，形似菜花样。在液体培养内呈粗糙皱纹状菌膜生长，若在液体培养基内加入水溶性脂肪酸，如Tween～80，可降低结核杆菌表面的疏水性，使呈均匀分散生长，此有利于作药物敏感试验等。

　　3、抵抗力

　　结核杆菌对某些理化因子的抵抗力较强。在干痰中存活6～8个月，若粘附于尘埃上，保持传染性8～10天。在3%HCI或NaOH溶液中能耐受30分钟，因而常以酸碱中和处理严重污染的检材，杀死杂菌和消化粘稠物质，提高检出率。抗染料，在培养基中，加入孔雀绿可抑制杂菌生长。但对湿热、紫外线、酒精的抵抗力弱。在液体中加热62～63℃15分钟，直射日光下2～3小时，75%酒精内数分钟即死亡。

　　4、变异性

　　结核杆菌对链霉素、利福平、异烟肼等抗结核药物较易产生耐药性。耐药菌菌株常伴随活力和毒力减弱，如异烟肼耐药菌株对豚鼠的毒力消失，但对人们仍有一定的致病性。

二、结核杆菌t细胞检测

　　结核杆菌T细胞检测是以特异性抗原为刺激源，应用酶联免疫斑点技术(ELISPOT)诊断结核感染的新方法。

　　T-SPOT .TB是以EL ISPOT 技术检测结核感染的新方法, ELISPOT 技术是近20年发展起来的检测抗原特异性T细胞的技术, 是目前最敏感的检测抗原特异性T细胞的方法之一, 可以检测出1/100000-1/50000外周血单个核细胞(PBMCs)中经某种抗原刺激后释放某种细胞因子的细胞, 经过酶联显色后, 通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数,1个斑点代表1个细胞, 从而计算出抗原特异性细胞的频率。

　　结核感染后体内长期存在抗原特异性的记忆性T 细胞, 当再次遇到抗原刺激时, 能迅速活化增殖, 释放γ干扰素。基于此原理，英国学者Lalvani 建立了以RD1 编码的结核特异性抗原6 kD早期分泌靶向抗原 和10 kD培养滤过蛋白为刺激源, 检测外周血中结核特异性释放γ干扰素的T淋巴细胞, 从而诊断结核感染的新方法。T-SPOT .TB 2004年在欧洲、2005年在加拿大被批准使用, 2008年被美国FDA批准应用于临床诊断。

　　T-SPOT .TB的实验结果清晰, 易于判断。实验设有空白对照、阳性对照以及以ESAT-6 和CFP-10肽段库作为刺激原的两个实验孔。空白对照孔内斑点数小于10且阳性对照孔内斑点数大于20时视为实验有效。T-SPOT .TB的实验结果用每106PBMCs中斑点形成细胞的数目来描述, 即SFCs/106PBMCs。

　　根据抗原A或/和抗原B孔的反应判断结果：

　　(1)检测结果为“阳性”，参照以下标准：

　　①空白对照孔斑点数为0-5个时，(抗原A或抗原B孔的斑点数)-(空白对照孔斑点数)≥6;

　　②空白对照孔斑点数为6-10个时，(抗原A或抗原B孔的斑点数)≥2×(空白对照孔斑点数);

　　如果上述标准不符合且阳性质控对照孔正常时检测结果为“阴性”

　　(2)结果解释：

　　阴性结果：提示患者体内不存在针对结核分枝杆菌特异的效应T淋巴胞。

　　如出现以下情况，阴性结果不能排除结核分枝杆菌感染的可能：

　　①因感染阶段不同(如标本是在细胞免疫发生前获取的)引起的假阴性结果;

　　②少数免疫系统功能不全/基础疾病的情况，如HIV感染者、肿瘤患者、婴幼儿等;

　　③其它免疫学、实验非正常操作的差异。

　　阳性结果：提示患者体内存在针对结核分枝杆菌特异的效应T淋巴细胞患者存在结核感染。但是否为活动性结核病，需结合临床症状及其它检测指标综合判断。T-SPOT .TB结果不能作为单独的或是决定性的诊断结核病的依据。虽然ESAT-6和CFP-10在所有BCG菌株，以及绝大多数环境分枝杆菌中缺失，但T-SPOT .TB的阳性结果有可能是堪萨斯、苏氏、戈登或海分枝杆菌的感染引起的。

三、结核杆菌菌体成份与作用

　　结核杆菌无内毒素，也不产生外毒素和侵袭性酶类，其致病作用主要靠菌体成份，特别是胞壁中所含的大量脂质。脂质含量与结核杆菌的毒力呈平行关系，含量愈高毒力愈强。

　　1.脂质(Lipide)：脂质占菌体干的20～40%，占胞壁干重的60%，主要是磷脂、脂肪酸和蜡质，它们大多与蛋白质或多糖质结合成复合物存在。

　　① 磷脂能刺激单核细胞增生，并可抑制蛋白酶的分解作用，使病灶组织溶解不完全，形成干酷样坏死。

　　② 脂肪酸在脂质中比重较大，其中6,6～二分枝酰～a ,a'～海澡糖具有破坏细胞线粒体膜，毒害微粒体酶类，抑制中性粒细胞游走和吞噬作用，引起慢性肉牙肿。具有该物质的结核杆菌毒株，在液体培养基中能紧密粘成索状，故称为索状因子(cordfactor)。

　　③ 蜡质D为胞壁中的主要成分，是一种肽糖脂(Piptidoglycolipids)与分枝菌酸(My-colic acid)复合物，能引起迟发型变态反应，并具有佐剂作用。

　　④ 硫酸脑苷脂(salfatides)和硫酸多酰基化海澡糖(Multiasiylated trehalose salfate)在结核杆菌毒株胞壁中含有，能抑制吞噬细胞中的吞噬体与溶酶体融合，使结核杆菌在细胞内存活。这一类糖脂能结合中性红染料。产生中性红反应，借此可鉴定结核杆菌有无毒力。

　　2.蛋白质(Protein)：结核杆菌菌体内都含有数种蛋白质，其中重要的蛋白质是结核菌素(tuberculin)。结核茵素与蜡质D结合，能引起较强的迟发型变态反应。其他蛋白质可引起机体产生相应的抗体，但无保护作用。

　　3.多糖质(Polysuccharides)：多糖质常与脂质结合存在于胞壁中，主要有半乳糖，甘露醇、阿拉拍糖等。多糖质可使中性粒细胞增多，引起局部病灶细胞浸润。

　　4.核酸(Nucleic acid)：结核杆菌的核糖体核糖核酸(Ribonucleie acid ribosonic , rRNA)是本菌的免疫原，刺激机体产生特异性细胞免疫。

四、结核杆菌致病性

　　结核杆菌的致病作用可能是细菌在组织细胞内顽强增殖引起炎症反应，以及诱导机体产生迟发型变态反应性损伤有关。

　　1、原发感染

　　原发感染是首次感染结核杆菌，多见于儿童。结核杆菌随同飞沫和尘埃通过呼吸道进入肺泡，被巨噬细胞吞噬后，由于细菌胞壁的碳酸脑苷脂抑制吞噬体与溶酶体结合，不能发挥杀菌溶菌作用，致使结核杆菌在细胞内大量生长繁殖，最终导致细胞死亡崩解，释放出的结核杆菌或在细胞外繁殖侵害，或被另一巨噬细胞吞噬再重复上述过程，如此反复引起渗出性炎症病灶，称为原发灶。原发灶内的结核杆菌可经淋巴管扩散在肺门淋巴结，引起淋巴管炎和淋巴结肿大，X线胸片显示哑铃状阴影，称为原发综合征。随着机体抗结核免疫力的建立，原发灶大多可纤维给的钙化而自愈。但原发灶内可长期潜伏少量结核杆菌，不断刺激机体强化已建立起的抗结核免疫力，也可作为以后内源性感染的来源。只有极少数免疫力低下者，结核杆菌可经淋巴、血流扩散至全身，导致全身粟粒性结核或结核性脑膜炎。

　　2、继发感染

　　继发感染也称原发后感染，多见于成年人。大多为内源性感染，极少由外源性感染所致。继发性感染的特点是病灶局限，一般不累及邻近的淋巴结，主要表现为慢性肉芽肿性炎症，形成结核结节，发生纤维化或干酪样坏死。病变常发生在肺尖部位。