利用CRISPR/Cas9系统治疗HBV感染取得突破性进展

　　2016年07月27日讯 乙型肝炎病毒（HBV），简称乙肝病毒，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科（Hepadnavividae），可导致肝硬化和肝癌的发生，给全球带来严重的疾病负担。据世界卫生组织（WHO）报道，全球有20多亿人曾受到过乙型肝炎病毒（HBV）感染，大约3.5亿至4亿人罹患慢性乙肝病毒（HBV）感染，在亚洲和非洲发病率尤其高。我国的乙肝病毒感染率约60%-70%；乙肝表面抗原携带率约占总人口的7.18%，以此计算，全国约有9300万人携带乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。

　　尽管现有的抗病毒药物可以控制乙型肝炎病毒，但却不能完全清除它。因此，一旦停止治疗患者肝脏中的HBV会重新活化。这是因为cccDNA “匿藏”在细胞核中。

　　细胞外的乙型肝炎病毒DNA是一种松弛环状的双链DNA（relaxed circularDNA，rcDNA）分子。HBV的基因组（rcDNA）进入到细胞核后，rcDNA在病毒蛋白和宿主细胞因子的帮助下修复成共价闭合环状DNA（cccDNA）。cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板。

　　只要还存在于肝细胞中，乙肝病毒cccDNA的复制就不会停止，并与病毒蛋白装配成新的完整HBV病毒颗粒，以芽生的方式再感染健康的肝细胞，而这是导致乙肝复发的根本原因。因此，尽管每个肝细胞内只有约5--50个cccDNA拷贝，但是只要这些cccDNA池稳定，就可以使得病毒的持续感染延续，因而清除肝细胞内的cccDNA是乙肝彻底治愈所必需的。

　　CRISPR/Cas9系统靶向结合特异性的DNA序列，诱导靶DNA双链发生精确切割。在哺乳动物细胞中，这样的切割能够被一种被称作非同源末端连接（non-homologous end-joining, NHEJ）的紧急修复系统快速地修复。NHEJ是高效的，但是并不很准确，因而经常导致一些DNA碱基在修复位点上插入或剔除。鉴于每次读取DNA时是按密码子（每个密码子由连续的三个碱基组成）读取的，在关键位点上发生的这些小的DNA序列变化经常破坏相应的基因和它的蛋白产物的功能。基于此，世界各地的研究人员尝试利用CRISPR/Cas9系统治疗HBV感染，并且取得重大进展。

　　利用CRISPR/Cas9系统高效地抑制HBV

　　在一项新研究中，麻省理工学院的研究人员利用CRISPR/Cas9 系统，对受到HBV感染的哺乳动物肝细胞进行基因组编辑，从中删除了乙肝病毒（HBV）DNA。他们靶向切割了HBV病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）中的一些特异性位点。

　　在这项研究中，Vyas Ramanan和同事们设计了24条单向导RNA（sgRNA）来靶向从在线病毒序列信息资源库中鉴别出的一些HBV基因组位点。经过初筛测试后，研究小组将三种最有效的sgRNA和Cas9蛋白插入到慢病毒载体中，然后将它们转导进将HBV DNA整合到宿主基因组的人类肝细胞内。

　　通过利用包含整合性HBV基因组DNA的稳定转染细胞系展开实验，研究人员观察到HBV总DNA和cccDNA逐渐减少，在36天时cccDNA下降了92%。他们还观察到HBV病毒基因表达和复制水平显著减少。

　　如今，Ramanan计划在人类肝脏嵌合小鼠模型中测试这一方法，以评估和优化传递方法和给药方法，及更好地了解需要除去多少的cccDNA才能到达人类功能性的治愈。

　　利用CRISPR/Cas9抑制HBV感染

　　在一项新的研究中，为了研究源自传染性HBV的cccDNA是否能够被直接靶向摧毁，来自美国福克斯蔡斯癌症中心（Fox Chase Cancer Cente）的研究人员在表达HBV受体---钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP）---的人HepG2中使用CRISPR/Cas9基因编辑系统。他们测试了不同的HIV特异性的向导RNA（gRNA），并证实它们能够高达8倍地抑制HBV感染。这种抑制是HBV cccDNA发生突变和缺失---类似于Cas9切割染色体DNA和随后基于NHEJ介导的DNA修复时观察到的情形---所导致的。α干扰素（IFN-α）并不对CRISPR/Cas9系统的抗病毒活性产生可衡量的影响，这提示着Cas9和NHEJ活性并不受这种细胞因子（即IFN-α）诱导的先天免疫反应的影响。

　　利用CRISPR/Cas9让HBV cccDNA功能性灭活

　　在一项新的研究中，通过采用下一代测序（NGS）技术，来自美国福克斯蔡斯癌症中心（Fox Chase Cancer Cente）的 Christoph Seeger、Ji A Sohn和同事们确定了在Cas9切割和基于非同源末端连接（NHEJ）的修复后，HBV cccDNA所发生的完整突变谱。他们发现，90%以上的乙肝病毒DNA都能被Cas9切割。此外，研究结果还表明，在Cas9切割后对HBV DNA进行基因编辑的效率是在对被HBV感染的细胞进行α干扰素（IFN-α）处理后发生的APOBEC蛋白介导的胞嘧啶脱氨基作用的1500倍以上。研究还发现，以前用来检测DNA胞嘧啶脱氨基作用的3D-PCR方法方法高估了发生基因编辑的HBV DNA的数量和频率。

　　总之，研究人员证实CRISPR/Cas9系统是迄今为止在功能上让HBV cccDNA失活和提供一种慢性乙肝治愈疗法的最好途径。