湖北农科院用CRISPR制备基因敲除克隆猪

　　2016年08月28日讯 来自湖北省农科院畜牧兽医研究所、河南科技大学和中科院水生生物研究所的研究人员，用CRISPR/Cas9系统和Cre/LoxP，敲除了猪初生细胞中肌生成抑制蛋白（MSTN）的一个等位基因，制备了无选择标记的MSTN基因敲除克隆猪。

　　可预测的、无污染的转基因家畜，对于可靠的表型和生物安全，都是很重要的。因为不想要的序列的引入，如SMGs（选择标记基因），已经引起了公众对于食品安全、生物多样性和农业生态系统的强烈担忧。SMGs经常用于细胞介导的转基因，使我们能够分离出转基因细胞。但是一旦操作完成，它们在从这些细胞制备而来的GM家畜中，就没有任何价值，相反，残留在家畜中的SMGs还可能成为一种负担。

　　有几种方法可以用来制备无SMG的转基因家畜。然而，到目前为止，这些方法固有的技术局限性，阻碍了无污染转基因方法的常规使用。例如，将一个表达组件直接显微注射到受精卵中，可避免任何SMG的使用，但是效率非常低、随机整合并存在潜在的嵌合现象，从而导致这种方法是不切实际和昂贵的。相反，传递mRNA或编码蛋白质的可编程核酸酶（如CRISPR/Cas9），已被证明是制备无SMG转基因家畜的一种有效策略。

　　Cre/LoxP重组系统被广泛用于转基因小鼠，用以组织特异性的基因打靶以及基因切除。然而，Cre/LoxP在转基因家畜中仍未得以很好的研究，只有少数研究描述了它在大型动物中的效用。

　　在这项研究中，研究人员通过CRISPR/Cas9和Cre/LoxP制备了无SMG的功能性MSTN（肌生成抑制蛋白）基因敲除克隆猪。他们利用CRISPR/Cas9介导的同源重组（HR），来敲除猪初生细胞中MSTN的一个等位基因。然后，用Cre重组酶来切除SMG，有效率为82.7%。研究人员通过流式细胞仪分离出了无SMG的非EGFP细胞，并被立即用作供体细胞核用以核移植。分子测试在这项克隆猪中验证了单等位基因MSTN KO和SMG删除。免疫印迹显示，在MSTN中大约有50%的降低，同时肌原性基因在肌肉中的表达有所增加。组织学检查显示，肌纤维数量增加，但是肌纤维大小保持不变。超声波检测显示，最长肌大小增加，背脂肪厚度降低。猪MSTN基因的精密编辑，产生了无SMG的MSTN KO克隆猪，提供了一种可靠的途径用于家畜良种生产，也提出了一种策略来减少潜在的生物学风险。

　　另外在今年6月，Nature子刊《Scientific Reports》在线刊登了同济大学、中科院上海生命科学研究院、上海交通大学以及加州大学洛杉矶分校的一项研究成果。在这项研究中，研究人员用CRISPR技术制备了一组Lep突变大鼠，它们在成熟LEP蛋白中携带14th Ile （LEP?I14）无效突变或者缺失。

　　肌生成抑制蛋白（Mstn）是哺乳动物骨骼肌质量的一个保守的负调节因子。然而，在家畜中是否能够实现Mstn的精确敲除，能否被安全地用来提高产肉性能，尚未得到证实。近期，来自南京农业大学、斯坦福大学等处的研究人员，在Nature子刊《Scientific Reports》发表题为“Generation and evaluation of Myostatin knock-out rabbits and goats using CRISPR/Cas9 system”的研究成果，该研究利用CRISPR/Cas9来制备Mstn基因敲除家兔和山羊，然后分析了它们的表型变化，对上述问题进行了探讨。

　　到目前为止，密切模拟人类病理和行为缺陷的神经系统疾病猴模型，还没有被成功地制备出来。8月9日，国际学术期刊《Cell Research》在线刊登了我国科学家的一项重要研究成果，这项研究采用TALEN技术，制备了小头畸形致病基因MCPH1突变体食蟹猴模型，并对这种MCPH猴模型的表型进行了描述。