浙江大学最新文章利用CRISPR/Cas9技术敲除基因

　　2016年08月28日讯 基因组编辑技术（Genome editing）是通过基因工程表达的序列特异的核酸酶对基因组进行切割，实现基因定点敲除、敲入等修饰，在基础生物学领域的反向遗传学研究、农业领域的种质改良和医学领域的基因治疗等方面有重要的应用价值。

　　来自浙江大学生科院的研究人员在 Golden-gate 克隆技术的基础上，通过两轮 PCR 反应，建立了将每 3 个sgRNA 串联到同一个入门载体中的方法体系，Golden-gate 克隆技术的核心是用 IIs 型限制性核酸内切酶，该类酶的切割序列位于识别序列之外，从而能产生多种粘性末端，有利于多个 DNA 片段按照指定的意向连接。这项研究获得了拟南芥（Arabidopsis thaliana）IAA2 基因的碱基插入突变和大片段缺失突变，整个实验体系具有快速、高效等优点。

　　CRISPR/Cas是细菌和古生菌抵抗病毒或外源质粒入侵的获得性免疫系统，主要有 3 种类型： I型、 Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅱ型系统被广泛应用于基因组编辑技术。嗜热性链球菌（Streptococcus thermophilus）具有典型的Ⅱ型 CRISPR/Cas 系统，该系统编码tracrRNA（Trans-activating crRNA），能指导 RNaseⅢ和 Cas9 完成前体 crRNA 的成熟；随后， tracrRNA与成熟的 crRNA 的互补序列配对形成 RNA 二聚体，作为向导 RNA（Guide RNA, gRNA），引导 Cas9 蛋白识别和降解入侵的外源 DNA。通过人工设计，研究者将 tracrRNA/crRNA 二聚体改造成单一向导RNA（Single guide RNA, sgRNA），极大方便了基因组编辑技术的研究。

　　Cas9 蛋白是一种核酸内切酶，含有两个核酸酶结构域： RuvC-like 结构域和 HNH 核酸酶结构域。HNH 结构域切割与 crRNA 互补的模板 DNA 链，切割位点位于原型间隔序列毗邻基序（Protospacer adjacent motif, PAM）上游 3nt 处；而 RuvC-like 结构域对另一条 DNA 链进行切割，切割位点位于 PAM 上游 3--8nt 处。

　　在基因组编技术中， sgRNA 指导 Cas9蛋白在目的基因的 PAM（保守碱基序列为 NGG）上游切割，产生 DNA 双链断裂（Double strands break,DSB）。 DSB 产生以后，细胞主要通过两种方式进行修复：同源重组（Homologous recombination, HR）和非同源末端连接（Nonhomologous end joining,NHEJ）。

　　多细胞真核生物主要通过 NHEJ 的方式修复 DSB。由于 NHEJ 只是将断裂的 DNA 片段进行简单的加工之后连接起来，常常会在断裂位点产生碱基的缺失或插入，造成基因突变。1 个 sgRNA 只能靶向基因的 1 个位点，有时基因突变的效率并不高，这是因为预测 sgRNA 效率的体系和方法还不是很完善。多个 sgRNA 能靶向同一基因的不同位点，提高基因突变的频率；也能造成较大片段的缺失突变，适用于 miRNA 基因的基因组编辑和某些疾病模型的建立。另外，多个 sgRNA 也能靶向不同的基因，特别是同一信号通路、同一代谢途径或同一基因家族的基因，在基础生命科学研究中具有重要的应用价值。

　　IAA2（Indole Acetic Acid 2）是拟南芥Aux/IAA生长素响应基因大家族中的一员，目前还没有它的突变体的报道，阻碍了对其功能和作用机制的深入研究。在CRISPR/Cas9基因组编辑技术中，1个sgRNA只能靶向基因的1个位点，有时基因敲除的效率并不高。

　　为了提高敲除效率，在这篇文章中，研究人员在Golden-Gate克隆技术的基础上，通过两轮PCR扩增，将每3个sgRNA串联到同1个入门载体中，再将入门载体与含Cas9表达框的目标载体LR反应，获得最终的表达载体。

　　结果表明，设计的6个sgRNA有4个发挥了作用，产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种可遗传的突变。与单个sgRNA相比，多重sgRNA的基因敲除效率高、种系突变多；与其他构建多重sgRNA载体的方法相比，本方法具有快速、高效等优点。研究所得到的5个突变体为后续的IAA2功能研究提供了良好的材料。