CRISPR基因编辑系统的最新研究成果

　　2016年08月31日讯 最近，科学家们利用CRISPR-Cas9首次让人细胞变身为记忆存储系统，有望靶向清除多种疱疹病毒感染和用于治疗血液疾病，直接改变细胞身份，高效和特异性地实现靶DNA单碱基突变等等。更为重要的是，我国科学家将进行世界首个人类CRISPR基因编辑临床试验。

　　CRISPR基因编辑技术或有望治疗血液疾病

　　刊登于国际著名杂志Nature Medicine上的一项研究报告中，来自圣犹大儿童研究医院的研究人员通过研究利用CRISPR基因编辑技术就可以帮助治疗镰刀形细胞病以及β地中海贫血症，该研究为后期通过基因组编辑技术来开发治疗常见血液障碍的新型疗法提供了一定帮助。

　　研究者Mitchell J. Weiss说道，我们所利用的基因编辑方法对于治疗遗传性胎儿血红蛋白持续存在症具有一定益处，我们很早就知道，机体中胎儿血红蛋白水平持续升高，且携带遗传突变的个体往往对镰刀形细胞病及β地中海贫血症的症状有一定的耐受性，严重贫血的遗传形式在地球上很多区域都非常常见，这项研究中研究者就发现了一种方法，可以利用CRISPR基因编辑技术来对患者产生类似的有益效应。

　　此前研究者们知道，抑制或逆转血红蛋白亚单位的γ-β开关就可以提高成年人机体中胎儿血红蛋白的水平，同时还会明显改善β地中海贫血症或镰刀形细胞病患者的虚弱症状，研究者Weiss补充道，这项研究中我们发现了一种基因组编辑介导疗法的潜在DNA靶点，并且为治疗β地中海贫血症及镰刀形细胞病提供了一种新方法。如今我们利用CRISPR基因编辑技术就可以靶向作用DNA，移除刺激γ-β开关的DNA片段，同时促进成体红细胞中胎儿血红蛋白水平的持续性增长。

　　本文研究就揭示了除现有许多创新性策略的另外一种方法，同时研究者还比较了该实验系统所产生的胎儿血红蛋白的水平。利用基因组编辑技术来恢复遗传性胎儿血红蛋白持续存在症或许是一种非常有吸引力的选择；研究者强调说，目前利用这种新型基因编辑方法进入临床试验还维持过早，后期我们希望能够继续深入研究来改善基因编辑过程，并且再进行其它实验来将潜在有害的脱靶突变的可能性降到最低，此外对不同方法进行对比来确定哪种方法最安全且最有效也是非常关键的，有待于我们后期进一步研究分析。

　　利用改进的CRISPR/Cas9技术直接改变细胞身份

　　在一项新的研究中，来自美国杜克大学的研究人员开发出一种不再需要导入额外基因拷贝的策略。相反，他们利用一种经过基因修饰的CRISPR/Cas9基因编程技术直接激活已经存在于细胞基因组中的自然拷贝。

　　在这项新的研究中，Black、Gersbach和同事们利用经过基因修饰的CRISPR/Cas9技术准确地激活三种基因Brn2、Ascl1和Myt1l来自然地产生这些控制神经元基因网络的主转录因子，而不是导入携带这些额外基因拷贝的病毒。

　　研究人员先将细菌防御系统CRISPR/Cas9进行基因修饰让它与一种基因激活物偶联在一起，这样仍然能够鉴定出特异性的DNA片段，但是不会切割靶片段，而是让它们保持完整，同时利用基因激活物将靶片段激活。

　　在实验室中，将这种经过基因修饰的CRISPR/Cas9系统注射到小鼠胚胎成纤维细胞中。检测结果表明一旦被这种系统激活，这三种神经元主转录因子基因就强力地激活神经元基因。这导致这些成纤维细胞传导电信号---神经元的一种典型特征。而且即便将与CRISPR/Cas9偶联的基因激活物取走后，这些细胞仍然保持它们的神经元性质。

　　这些实验证实利用这种经过基因修饰的CRISPR/Cas9技术产生的神经元在靶基因上的表观遗传程序与在小鼠大脑组织中自然发现的神经元标志相匹配。

　　根据Black的说法，接下来的行动方案就是将这种方法拓展到人类细胞中，提高这种技术的效率，并且试图清除其他的表观遗传障碍，这样它可能能够用来构建特定疾病模型。

　　利用改进的CRISPR/Cas9系统高效和特异性地实现单碱基突变

　　在一项新的研究中，利用一种引入DNA单个核苷酸变化的脱氨酶，来自日本神户大学的研究人员构建出一种改进的CRISPR/Cas9工具，从而避免产生有害的双链断裂，使得利用CRISPR/Cas9技术引入的附带突变最小化，而且也不需要加入DNA模板。

　　利用CRISPR/Cas9系统，人们通过将Cas9导入到细胞中对一种DNA序列进行编辑而产生双链断裂，同时也将一种DNA模板导入到这种细胞中，这样该细胞利用这种DNA模板修复这种断裂。这种编辑过程依赖细胞的同源重组机制，然而其他的修复机制如NHEJ也来竞争执行这种修复任务，因而经常导致不想要的和不准确的序列插入和删除。

　　为了构建一种更加准确的编辑工具，神户大学科学家Akihiko Kondo和他的同事们将一种没有核酸酶活性的不能够切割双链DNA的Cas9版本或一种产生单链切口的切口酶Cas9版本与一种来自七鳃鳗（sea lamprey）免疫系统的激活诱导性胞苷脱氨酶（activation-induced cytidine deaminase, AID）融合在一起。在正常情形下，这种AID酶在免疫球蛋白和抗体基因中产生突变从而让免疫系统具有多样性。AID作用在单链DNA上，将胞嘧啶（C）替换为尿嘧啶（U），随后在一轮DNA复制中，这种尿嘧啶（U）被转化为胸腺嘧啶（T）。

　　通过测试这种新的杂合复合物是否能够在出芽酵母---缺乏一种内源性的类似AID的系统---中修饰一种选择性的标志物，Kondo团队发现当在向导RNA（gRNA）的引导下，这种蛋白复合物靶向作用于CAN1基因，而且相对于非靶向的选择性标志物，CAN1基因发生突变的频率增加了1000倍。利用全基因组测序，研究人员发现很少的脱靶突变，只比背景突变率略有增加。论文第一作者、Kondo实验室博士后研究员Keiji Nishida说，“[在AID存在下]，这种脱靶突变率是可以接受的，相比于自然的背景突变率增加了不到10倍。”

　　研究人员也证实将两种不同的gRNA与Cas9-AID复合物一起表达能够同时对两种基因进行修饰。

　　相比于没有核酸酶活性的Cas9-AID复合物，切口酶Cas9-AID复合物能够在核苷酸替换位点的相反链上产生切口，基因编辑效率略高一些。Nishida解释道，这是因为核苷酸切除修复（nucleotide excision repair, NER）能够修复AID产生的核苷酸替换，“如果在互补链上产生一个切口，那么就不再有参照链来校正替换突变”，从而使得想要的核苷酸替换过程更有效率地进行。

　　为了进一步修饰，研究人员将尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil DNA glycosylase）抑制剂---与这种Cas9-AID复合物连接在一起，从而增加这种复合物产生C-T替换的效率，同时使得在哺乳动物细胞系中发生的不想要的缺失突变最小化。

　　这种基因编辑复合物也能够在哺乳动物细胞系中表现良好，导致相对少的脱靶突变。在酵母细胞中，相对于表达标准的CRISPR/Cas9系统，表达上述两种改进的DNA编辑复合物中的任何一种都能够导致它们更好的生长，这提示着这种新的编辑工具也是毒性更小的。