深入剖析！如何利用CRISPR技术编辑人类诱导多能干细胞？

　　2016年09月06日讯 过去10年里诞生了两种非常有用的生物学工具，第一个就是人类诱导多能干细胞（iPSCs），这是一项荣获诺贝尔奖的先进科技产物，2006年时研究者开始对小鼠进行实验，随后在人类机体中进行实验，研究者表示他们有可能将成体的皮肤细胞转化成为多能干细胞，随后这些多能干细胞就能够被诱导转化成为任何类型的细胞，这些细胞是个体基因组在细胞尺度的化身，而且其可以帮助科学家开发出那些不能取自活体的细胞类型，ipsCs通常能够提供方法来模仿单成因及复杂的人类疾病，同时还可以指导进行基于细胞的疗法。

　　第二项工具就是CRISPR-Cas9系统，其能够对基因组中的任何区域进行准确的编辑，当涉及传统永生的细胞系，比如HeLa或HEK293细胞系时，利用CRISPR进行切割或许会作为一个新手让研究者学习数周，第二波基于CRISPR的方法常常是通过增强或者减弱基因表达的水平来发挥作用的，而不是进行基因的切割，这或许可以使得这种方法变得更加有用。

　　上述两种技术的结合或将带来不可估量的效应，利用CRISPR编辑的iPSCs可以使得科学家对基因进行操作来研究在特殊疾病背景下的基因功能，或者去纠正病人细胞中的遗传缺陷，而其中一种挑战就是帮助定位的无缝基因编辑技术或许就能够确定不同ipsC细胞系的遗传变异，CRISPR-Cas9技术就能够帮助科学家制造出新型的仅通过单个核苷酸改变且用作特殊个体的质控细胞。

　　尽管CRISPR-Cas9和人类iPSCs已经成为研究者在实验室中老生常谈的话题了，但对两者进行统一却并不容易，想要研究基因功能的科学家如今正在发现，在培养基中很难维持人类ipsCs，而且也很难利用CRISPR进行操作。

　　最基本的工作流程

　　编辑且控制人类iPSCs细胞中的基因表达往往以两条平行的工作流开始，首先就是保证多能细胞的可靠来源，其次就是设计导向RNA，即可以靶向作用基因且具有20个核苷酸的序列。为了利用导向RNA和Cas9核酸酶来转染细胞，电穿孔技术就是主要的方法，因为其能够帮助科学家在维持细胞活性的同时将大量的DNA及蛋白质输入到细胞中，由于人类多能干细胞在运输过程中会沉默基因的表达，因此就应当尽可能地避免慢病毒运输。研究者通过追踪细胞的形态、多潜能标志以及细胞分化的能力来评估细胞的多能性，核型分析技术通常就能够确保细胞中有着正常数量的染色体，而且ipsC细胞系可以被用来广泛购买。

　　人类多能干细胞VS人类肿瘤细胞系

　　首先研究者在人类癌细胞系中尝试CRISPR-Cas9工具，当他们准备转移到研究人类多能干细胞时，他们发现人类的iPSCs属于劳动密集型分布，而且难以维持。来自哈佛医学院的研究者Susan Byrne说道，有经验的研究者常常会花费一个月时间来学习人类iPSC的基本培养技术，即使那样，由于新步骤和试剂的出现，利用这些细胞进行研究仍然是一个需要持续学习的过程。干细胞非常特殊，其质量影响着我们培养细胞以及利用导向RNAs靶向作用细胞的能力，而我们看到的改变依赖于单一的供体及重编程的方法，有时候我们不得不优化制造特殊干细胞系的步骤。来自霍普金斯大学医学院的研究者Linzhao Cheng说道，在一般情况下，甚至利用健康细胞系时，我们应当期望降低10倍效率来将对人类ipsCs和ESCs进行编辑。

　　开始了解我们的基因

　　研究者表示，我们应当研究基因位点并且理解这些序列的功能，比如，在基因编辑之后被干扰的基因仍然会表现出某些生物活性，在某些情况下我们应当考虑基因位点发生了双重切割，而这目的是为了切除更大的基因区域。

　　选择多种导向RNAs并且对其进行检测，如今大量的软件都能够选择导向RNAs，但我们要记住，特殊的导向RNA似乎并不能很好地进行工作，或者根本不会工作；来源于事实的一个非常简单且最容易被忽视的原因就是根据我们的向导设计我们或许并没有相关的基因组，此外我们也应当需要考虑向导的活性。

　　敲除VS精确编辑

　　当利用CRISPR-Cas9切割基因时，两个主要的分子途径就会开启来进行DNA修复，而且最终会确定随后编辑作用的保真性，这两个修复通路同时会发生，用作基因敲除的非同源性末端接合（NHEJ）能够在DNA中产生小型的插入位点或剔除位点来阻断基因的功能；另外一种名为同源性直接修复（HDR）的作用则会基于供体的长链DNA来产生精确的核苷酸改变。

　　目前研究者Hockemeyer及其同事正在开发新型策略来使得同源性直接修复发挥主要作用，比如应用特殊的化学物或利用来自不同物种的Cas9酶等，研究者说道，我认为在未来几年里我们解决这些问题指日可待。

　　研究者Conklin的团队开发出了一种快速的数字PCR技术，其能够对HDR和NHEJ的修复率进行定量，在包括人类ipsCs的多个细胞类型中，上述两种修复率并没有互相关联，这就表明，相比单单测定一种修复率而言，同时测定两种修复率是非常明智的，尤其是当目标是HDR的时候。

　　对切割进行特性描述

　　在细胞分化前和分化后，测定或者掌握细胞的表型，比如形状或特殊标志物的存在，都是我们证实是否在合适位置切割的最基本的方法，利用和待编辑基因互补的DNA来补充编辑的细胞或许能够恢复细胞的表型，如果细胞表型太精细不能测出微小改变的话，研究者或许就应当尝试对基因进行第二次编辑来将其恢复至野生型。

　　此外研究者还抽取了基因编辑的基因组进行调查，比如利用这些区域的PCR和Sanger测序结果等，一种名为TIDE的算法可以重建预期突变的身份，同时还能够揭示其发生的机制。研究者Mali说道，对所有的蛋白编码基因和外显子组进行测序或许就能够帮助挑选已经验证的编辑，测序是当前的主要分析方法；从另一方面来讲，随着时间遗传差异性会不断积累，而这与细胞系并无关联。

　　脱靶效应

　　一种抑制脱靶编辑的主要方法就是至少利用两种或多种靶向作用相同位点的不同“向导”，而这或许并不可能给出相同的脱靶结果；一般而言，脱靶效应并不是主要的问题所在，至少对于大多数基础科学家而言是这样的，相比癌细胞系而言，脱靶效应往往并不太可能发生于人类的多能干细胞中，但研究者如果真得非常关心的话，进行全外显子组测序或许就是最佳的方法了。

　　控制基因的表达而不是对基因进行编辑

　　如果希望对多能干细胞中对多能性表现非常重要的基因进行敲除的话，很明显我们的运气并不够好，我们或许并不能用死细胞得出太多信息，在这种情况下，我们就需要提高或减弱基因的表达，而扩大CRISPR-Cas9工具的功能或许就能达到这种目的；研究者们通常会使用一种“死亡版本”的Cas9，其能够结合到基因组中的预定位置但并不会切割DNA序列，相反，死亡版本”Cas9的不同突变体要么会抑制转录（称之为CRISPR干扰，CRISPRi），要么会激活表达。

　　近来一项研究发现，对ipsCs筛查寻找功能缺失区域时，相比CRISPR-Cas9而言，CRISPRi或许会比传统的CRISPR更加有效，CRISPRi能够沉默95%的细胞中的基因表达，而CRISPR-Cas9仅能够沉默60%至70%细胞中基因的表达，这是因为CRISPR-Cas9并不总是会引发移码突变，而移码突变通常会使得蛋白质部分或完全失去功能，也就是说，成功地沉默基因的表达往往因细胞类型和位点不同而不同。

　　基因表达控制和基因编辑之间的主要差异就是，在基因表达控制下，我们或许并不能永久地改变基因组，我们可以扰乱细胞的功能，比如沉默基因表达随后逆转基因的抑制作用；此外，相比CRISPR-Cas9而言，脱靶效应或许更少地同CRISPRi和CRISPRa（CRISPR激活）相关。调节基因表达面临的一个挑战就是研究者很难选择或设计一套坚实的导向RNAs，研究者表示，在理想状况下他们可以避免基因组的区域被核小体紧密围绕，而蛋白的缠绕往往会使得基因沉默，但在某些情况下，这些区域就很有可能是研究者所要靶向作用的区域。

　　对于研究者而言，将CRISPRi和CRISPRa有效成功地运输到人类多能干细胞中非常复杂，研究者Cowen指出，目前除非使用病毒载体的运输方法，否则仍然很难将CRISPRi和CRISPRa运输到70%至80%的细胞中，而目前我们仅仅谈论的是30%至40%的细胞，研究者认为这或许能给他们带来一定帮助，因为在某些情况下他们很难或者不可能将ipsC分化成为特殊类型的细胞，研究者Cowen长期利用CRISPRa来激活并且验证报道基因，他表示，在我们实验室利用肾脏内皮细胞就能够知道报道基因是否在正常工作。