专家经验谈：如何用CRISPR编辑iPS细胞

　　2016年09月15日讯 CRISPR基因编辑和iPS重编程是生命科学领域近十年最热门的两大技术。现在，科学家们正在撮合它们联姻。

　　干细胞能够分化成为机体内任何类型的细胞，既是研究人体早期发育的理想工具，也是细胞治疗的宝贵资源。胚胎干细胞很适合临床使用，但获得这些细胞会破坏胚胎，有很大的伦理争议。2006年日本科学家山中伸弥开发了一个变通方案，用逆转录病毒将四个转录因子（OSKM）引入特化的成体细胞，再将其重编程为诱导多能干细胞（iPSC）。这些细胞在实验室中表现出与胚胎干细胞相当的能力，又避开了胚胎干细胞的伦理问题，在疾病模拟、药物筛选和细胞治疗中有着巨大的应用前景，被人们视为细胞疗法的新希望。山中伸弥也因为iPS技术赢得了2012年的诺贝尔生理/医学奖。

　　CRISPR是指规律成簇的间隔短回文重复，细菌通过CRISPR与内切酶Cas组成的防御系统对抗外来侵略者。CRISPR-Cas能根据向导RNA的指引切割入侵者的遗传物质。2012年研究者们利用这一特点，将CRISPR系统发展成了强大的基因组编辑工具。该系统可以简单精确地编辑任何基因组区域，据说新手可在一周内学会用CRISPR编辑传统的永生细胞系（比如HeLa或HEK293）。此外，研究者们还在CRISPR的基础上开发了调控基因表达的新工具。

　　人们普遍认为，iPS与CRISPR的结合会起到一加一大于二的效果。举例来说，CRISPR用于人类iPSC可以揭示基因在特定疾病中起到的作用，甚至可以校正患者细胞的基因缺陷。虽然CRISPR-Cas9和人类iPSC在实验室中已经相当普及了，但二者相结合并没有想象中那么容易。The Scientist杂志与多位正在使用这两个工具的专家联系，推出了在人类干细胞中使用CRISPR的基础指南。这份指南对人iPSC和人胚胎干细胞同样适用。

　　基本工作流程

　　在人iPSC中用CRISPR编辑基因或者控制基因表达，你需要开启两条平行的任务线：1）培养充足且可靠的多能干细胞；2）针对目的基因设计20nt的向导RNA。

　　研究者们目前主要通过电穿孔递送向导RNA和Cas9核酸酶，因为这种方法能在保证细胞存活的同时送入更多DNA和蛋白。你可以在市面上找到自动化的台式系统，比如Lonza的Nucleofector系统和ThermoFisher的Neon系统。Gladstone心血管病研究所的博士后Mohammad Mandegar奉劝大家，如果不是高通量细胞筛选，请不惜一切代价避免慢病毒递送，因为人多能干细胞似乎会天然沉默慢病毒送入的基因。

　　抗生素抗性可以帮助我们挑选经过编辑的克隆。研究者们一般将抗生素抗性、荧光报告基因和流式细胞仪结合起来，富集那些转染成功的细胞，把它们铺在单孔或多孔板上。通过追踪细胞形态、多能性标志物和细胞分化能力可以评估细胞的多能性。专家建议每10-20代或者每次细胞操作之后进行核型分析，确保细胞的染色体数量正常。

　　iPS细胞系如今有许多购买渠道，各大实验平台和公司都提供有相应的服务。此外，iPS重编程方案也非常多。加州大学伯克利分校的细胞生物学家Dirk Hockemeyer表示，我们应当找到最适合自己的方案，在开始CRISPR编辑之前一定要很好地掌握这些细胞。

　　人多能干细胞VS人肿瘤细胞系

　　专家们还建议，在着手iPSC之前先用人类癌细胞系试一试CRISPR-Cas9工具。在对iPSC动手的时候牢记一点：操作人iPSC更繁琐、更讲究也更加昂贵。

　　据介绍，有经验的研究者用大约一个月的时间能学会基础的人iPSC培养。由于新方案和试剂经常出现，操作这些细胞是一个不断学习的过程，哈佛医学院George Church实验室的博士后Susan Byrne说。“我告诉本科生，如果在正确的指导下操作这些细胞，你们将在六个月内成为专家。但人们一开始总是低估了这种技术，”哈佛干细胞研究所的Chad Cowan补充道。

　　请记住，每一个干细胞系都是独特的。这会影响细胞培养和向导RNA的效果 。“供体和重编程方法都会带来变异，”Byrne说。“有时我们需要对特定干细胞系进行方案优化。”一般来说，就算细胞系很健康、实验方案很完美，人iPSC和ESC的编辑效率也会比癌细胞系低十倍，Johns Hopkins大学医学院的Linzhao Cheng指出。

　　深入了解你的基因

　　知己知彼，百战不殆。了解你想要编辑的基因座，认识那些可能转录的序列，可以帮助你设计出最佳编辑方案。举例来说，有些基因在编辑之后仍能表现出一定的生物学活性。在这种情况下，你可能需要切割更大的区域，Byrne说。

　　选择多个向导RNA并对它们进行测试。现在已经有很多软件可以筛选向导RNA。不过，就算是特异性非常好的向导RNA也有可能效果不佳，甚至根本不起作用。造成这种情况的原因很多，比如你可能没有足够好的参考基因组。此外，你可能需要优化向导RNA的活性，加州大学圣地亚哥分校的生物工程师Prashant Mali说。他和George Church领导团队在Nature Methods杂志上发表文章，向人们展示了获得活跃向导RNA的通用设计规则。

　　将CRISPR应用到iPS细胞中去，可以实现个性化的干细胞治疗，造福多种遗传学疾病的患者。James Thomson与Murdoch儿童研究所（MCRI）合作，将重编程与CRISPR基因组编辑结合到一个步骤中，显著缩短了生成基因校正干细胞的时间，是实现个性化细胞疗法的重要一步。

　　2014年11月，遗传学大牛George M. Church领导的研究团队在Nature Communications杂志上展示了CRISPR编辑iPS细胞的脱靶情况。他们对人iPS细胞进行CRISPR基因编辑，然后将全基因组测序和靶向深度测序结合起来，鉴定了Cas9编辑iPS细胞时的脱靶效应。研究指出，CRISPR编辑人类iPSC并没有导致显著的基因组改变或突变率提高，不过有一种单核苷酸变异（SNV）会影响Cas9的特异性。