基因测序让科学家解码历史上的致命疾病

　　利用新方法，研究人员分析了提取自受害者骨头和牙齿的历经数世纪之久的病原体。

　　去年8月，johannes krause进行了一个鲜有人尝试的“壮举”：他对一具700年历史的人体骸骨进行了遗传尸检。krause从一个死于14世纪丹麦麻风病人隔离区的年轻女性牙齿中提取了dna，并计算了来自细菌、污染物以及麻风病病原体（麻风分枝杆菌）的混杂遗传物质有多少。

　　他惊讶地发现，40%的dna与现代麻风分枝杆菌相匹配，只有9%的dna是人类dna。作为德国宾根大学的古遗传学家，krause认为，这不可能。

　　他再次进行了研究，并得出同样的结论。“这是疯狂的。”他说，“我从未想过，人体骨骼中病原体的dna多于人类dna。而在当今麻风病患者中，你不会发现这种情况。”

　　重现历史

　　krause和他的研究生――生物化学家verena schuenemann意识到，自己撞上了一个科学头奖。“利用如此高浓度的细菌，我们试着让一个梦想成真。”schuenemann说。他们立刻测序了该古代杆菌基因组，而非像过去那样依赖实验室技术捕获分化的古老dna。

　　日前，krause及其同事将成果发表于《科学》杂志网络版，公布了使用鸟枪测序法测序的中世纪麻风分枝杆菌全基因序列。这个突破令人非常惊讶，因为研究人员尚未对从活着的麻风病人体内提取的麻风分枝杆菌基因进行直接测序。这种细菌不能在细胞培养中生长，因此研究人员用人类麻风分枝杆菌感染了犰狳和老鼠，以便获得足够的样本用于测序。

　　krause研究小组十分幸运地获得了样本。“我们在基因序列方面获得了难以置信的进展。”美国哈佛大学进化遗传学家charles nunn说，“这对理解在今天和过去循环的病原体之间的关系十分重要。”

　　利用铺天盖地的数据，一些实验室陆续采集了“传奇杀手”的dna，其中包括，结核病（tb）、鼠疫、霍乱、利什曼虫、麻风病、马铃薯晚疫病以及艾滋病。他们从古代牙齿、骨头、头发、排泄物和土豆皮与叶子中，收集到了这些“罪犯”的线索，然后解码了基因序列。

　　始于3年前的相关研究，为人们理解历史事件打开了新局面，看清了引发人类最严重流行病的“元凶”的真实面目。“很多存在于历史记录中的疾病，我们不清楚病原体是什么。”美国亚利桑那州立大学分子人类学家anne stone说。

　　相关研究还揭示了病原体首先感染人体哪一部分，以及为何随着时间的推移，它们会变得更毒或消弭。例如，了解很久之前的都市化引发严重tb杆菌的进化，在当今日益城市化的世界“能够发现最好的疫苗接种和药物治疗策略”，英国曼彻斯特大学生物分子考古学家terence brown说。

　　pcr难题

　　上世纪90年代初，没有人相信这会成为可能。当时stone还是一名研究生，在德国马普学会斯万特・帕博实验室工作，她曾试着识别古老天花和tb的基因标记。这项研究是一项挑战，病原体的基因组比人类基因小1000倍。回到那时，假如能够使用聚合酶链反应（pcr），测序来自化石的少量dna标记，研究人员会激动万分。

　　那时stone甚至无法攫取一些小块的片段。她试着放大取自一具有400年历史的意大利那不勒斯木乃伊的重型天花病毒，但是一无所获。她放弃了古病原体研究，转而研究古老dna与猿和人类的进化。

　　数年过去了，其他研究人员宣布使用pcr从骨骼残骸中搜获了tb，但是批评者担心证据受到了污染。甚至当他们能够确定古tb时，pcr研究停滞在了如何关联古tb菌株和现在的结核分枝杆菌，因为他们无法获得足够的古dna，以揭示菌株间的不同。“我不在乎有人说自己从1.5万年前的样本中提取了tb，我只想知道，你能告诉我有关这个tb的什么内容。”丹麦哥本哈根大学进化生物学家thomas gilbert说。

　　这大约发生在高通量测序仪器引发该领域革命的10年前。当时pcr只能复制至少80个碱基对长度的dna片段，但是古老dna通常更小。新测序机器打开了古老基因的全新世界，包括轰动一时的冰河时代猛犸象，以及灭绝的尼安德特人和丹尼索瓦人的基因修复。

　　捕获基因

　　通缉名单的头号凶手是黑死病的“代理人”。1347~1351年，它横扫欧洲，夺去一半人的生命。历史文献记载的腹股沟淋巴结炎十分像那些由耶尔森氏鼠疫杆菌引起的疾病。在抗生素出现之前，鼠疫似乎足以杀死上百万生命，因此一些历史学家怀疑，它是黑死病背后的“推手”。早期pcr结果表明，中世纪受害者遗骨上的遗传标记属于现代耶尔森氏鼠疫杆菌的一部分。但是罪名无法成立：实验结果不能重复。

　　2011年加拿大麦克马斯特大学的hendrik poinar、美国南卡罗来纳大学的sharon dewitte和麦克马斯特大学研究生kirsten bos从英国伦敦东史密斯菲尔德墓地尸骸的牙齿和骨头中提取了dna。这里埋葬了14世纪鼠疫的受害者。

　　联合krause和schuenemann，两个实验室使用了“诱饵”――发现自现代耶尔森氏鼠疫杆菌的短基因片段――用于捕获古老序列的类似延伸。研究人员清除了无法附在现代诱饵上的dna。这让他们不仅捕捉到了匹配序列，还发现了可能与现代基因不同的dna。研究人员反复清洗了重叠的dna片段，最终平均每个核苷酸收集了30个副本。

　　结果显示，伦敦瘟疫死者确实感染了耶尔森氏鼠疫杆菌。让该研究小组惊讶的是，14世纪该杆菌的基因组与现代十分相似。目前，研究小组在探索是什么引发了高死亡率，是一种古老菌株还是中世纪死者较差的健康状况。

　　结核病疑云

　　tb是世界致死率第二的传染病，仅排在艾滋病之后。2011年，它导致140万人死亡。在过去的10年中，研究人员修改了“所有人感染tb都是由几乎相同的结核分枝杆菌引起的”这一观点。他们现在认识到存在7种不同的tb菌株群落，有两个只在非洲和最近的非洲移民中发现。

　　tb与人类的交情“甚笃”：最早的考古学证据来源于一具发现自意大利利古利亚的有7800年历史的骸骨，其脊柱结节受损。最早的历史记录则出现在公元前4700年的中国。作为与人类和动物共同进化数千年的结果，菌株群落在旧世界（非洲、欧洲和亚洲）与新世界（美洲）出现单独进化。研究人员渴望了解新世界和旧世界菌株彼此间、与动物菌株间如何相关，以及感染人类的过程如何改变了tb的毒性。他们还想知道，耐药性是否发生在不同菌株的相同位置，以及速度有多快。

　　答案可能隐藏在时间的深处。stone和研究生luz-andrea pfister已经推翻了人最初是从牛身上感染了tb的旧观念――而是人们自己传染了自己。新研究追踪了现代菌株的共同祖先，结果显示，tb可能早在300万年前就感染了非洲人。目前尚未测序出完整的古结核分枝杆菌基因序列，但是科学家已经取得重大突破。

　　去年，一个研究小组从1840~1911年葬于英国利兹圣佐治土窑的一个小女孩骸骨上提取了样本。brown及其博士后abigail bouwman使用新一代测序仪等技术，制作了500个“诱饵”，捕获了218个单核苷酸多态性（snps）。通过分析古老和现代tb菌株中存在或不存在哪些snps，他们编译了首套历史上的tb菌株的dna标记。

　　通过比较，研究人员发现，利兹女孩感染的菌株与现代的不同，但是与1905年纽约隔离的一个患者体内的菌株几乎相同。该研究生动地展示了病原体如何在航空业发达之前，成功穿越如此长的距离。“有很多人跨越大西洋，其中许多去了美国。”brown说。

　　爱尔兰惨案

　　1845~1852年，爱尔兰马铃薯歉收使得100多万人死亡，另外超过100万人逃到了美国和其他国家。该国一直未从这场灾难中完全恢复过来。爱尔兰现有人口450万人，还不到饥荒发生时人口的3/4。

　　很多人将饥荒归咎于政治和植物，但是毫无疑问马铃薯晚疫病是罪魁祸首。当时，爱尔兰主要依赖单一马铃薯品种――绰号“码头工人”的大马铃薯――来养活日益增长的人口。一旦这种大马铃薯受枯萎病的袭击，人们就没有其他的马铃薯可以食用。

　　大部分科学家认为爱尔兰马铃薯枯萎病是由一种名为us-1的马铃薯晚疫病菌引起的，它是1843年引发北美枯萎病菌株的一个直接分支。直到上世纪70年代末，这种菌株在世界范围内一直占主要地位。

　　但是，研究人员发现这种菌株，与他们通过分析1845~1896年收集自欧洲和北美洲枯死的马铃薯和番茄的叶片而发现的菌株不同。英国塞恩斯伯里实验室的kentaro yoshida、schuenemann及同事测序了这些样本的dna：正如那个有700年历史的麻风病样本一样，马铃薯枯萎病病原体也被很好地保存下来，他们使用鸟枪测序法直接测序了其基因序列。

　　结果显示，这些古老植物感染了一种名为herb-1的马铃薯晚疫病菌，它与现代的15个马铃薯晚疫病菌株不同，尽管us-1与它密切相关。“一个已灭绝的菌株曾横行于爱尔兰和欧洲。”联合研究者krause说。

　　中世纪苦难

　　现在，高分辨率麻风分枝杆菌全基因序列使得krause和同事有机会深入研究这种自圣经时代就名声狼藉的可怕疾病。如今，麻风病早已不像中世纪那样横行无忌。德国基尔大学分子考古学家ben krause-kyora表示，就在14世纪前，斯堪的那维亚半岛25%甚至更多的成年人死后的骨骼留有麻风病的标记。

　　krause-kyora将中世纪麻风病死者的牙齿寄给krause用于分析，他们比较了古麻风分枝杆菌基因和11种现代菌株，结果发现，这种细菌进化速度很慢。中世纪麻风病患者身上的病原体几乎与目前印度、泰国等地麻风病患者体内的病原体相同。

　　krause研究小组还发现，中世纪斯堪的纳维亚女孩的麻风病菌株或许分离自发现于当今伊朗和土耳其的一个菌株。这表明这种原始菌株起源于亚洲。11世纪，十字军或其他旅行者可能将它带到了欧洲，最终到达斯堪的纳维亚半岛。

　　最后，krause还揭开了最初困扰他的难题：为何在古老牙齿中麻风分枝杆菌dna比人类dna多。他认为，麻风分枝杆菌有特别厚的细胞膜，富含脂肪酸，能够抗侵蚀。如果其他细菌也是这样，将有希望追踪那些超越人类dna退化极限（100万年）的病原体。