深度测序深入剖析人类机体整套免疫系统的功能

　　2016年6月29日讯 从研究者Susumu Tonegawa（利根川进）及同事发现哺乳动物免疫系统的抗体多样性秘密到现在已经过去40多年了；早在1978年，日本科学家Tonegawa就通过利用相对较低分辨率的工具发现，B细胞可以从大量收集的可变（V）、多样性（D）及连接（J）基因片段中有效地选择一个来产生功能性的抗体基因，同时研究者还可以通过剔除插入到基因组中的DNA来将上述基因片段连接起来，而这被称之为体细胞重组。

　　研究者Susumu Tonegawa因“发现抗体多样性的遗传学原理”获得了1987年的诺贝尔生理学或医学奖，然而细胞如何行使这些基因组操作工作依然是个谜题，如今非常感谢新一代的DNA测序技术使得这些机制重新被科学家们所关注，同时表观遗传学信号似乎也会影响偏远基因组元件的成环和重排的能力。

　　在一项研究中，来自英国巴布拉汉研究所（Babraham Institute）的研究人员Anne Corcoran和其同事就利用了一种名为VDJ-Seq的方法，结合高通量测序技术ChIP-seq及其它测序技术揭示了VDJ重组事件中V基因使用背后的表观遗传因素；VDJ重组即H链可变区的D基因的任一段与J基因拼成DJ基因后再与V基因任一段相结合而形成新基因的过程。

　　此外，来自伊利诺伊大学的研究者Amy Kenter又利用染色体构象俘获（3C）的高通量突变体解析了免疫球蛋白区域的染色体架构信息；上述这两项研究表明，转录因子结合及染色体构象在机体全部免疫系统形成中的复杂重要角色。

　　VDJ-Seq方法的图表

　　遗传偏差

　　小鼠的免疫球蛋白重链区包含了195个V基因，10个D基因以及4个J基因，其跨越了3Mb长度的基因组DNA，这些基因片段可以随机重组产生7800种基因组合方式，而且，每个重组片段中的随机核苷酸插入以及剔除，轻链基因，诸如体细胞高频突变等机制以及抗体产生的数量都会呈系数形式增长，然而基因的使用或许并不是完全随机的，有些V基因相比其它基因而言却会非常频繁地发生重组。

　　研究者Corcoran推测了隐藏在染色质结构及其它表观遗传改变背后的结果，他表示，虽然VDJ-Seq技术在不断变革，但他们意识到必须拥有大量的表观遗传学数据才能够在较大的免疫球蛋白区域进行绘图，但如今研究者并不清楚上述过程中每个基因使用的频率如何。

　　VDJ-Seq技术基于引物眼神到了J区域，所以该技术可以覆盖DNA中重组的VDJ基因组序列区域，通过捕获来自小鼠早期阶段祖B细胞（pro B cells）中的DNA，并且对相应片段进行测序；研究者指出，在小鼠被感染之前或暴露于病原体之前，这种新技术就可以对其机体一系列基因的使用情况进行大范围的普查。

　　在小鼠免疫球蛋白重链基因去的195个V基因中，128个基因都会发生频繁重组（活性状态），而67个基因则不会重组（失活状态）；为了理解活性和非活性基因区域间的差异，研究小组将V基因的使用数据同18个表观遗传学数据库（包括ChIP-seq和非编码转录数据库）相互关联，从而寻找可以预测基因重组的相关因子，最后研究者鉴别出了两种表观遗传学标记：A和E，这两种标记同活性重组之间存在一定关联，两者并没有参与种系的转录，研究者意外发现，这种转录或许会被认为在重组中扮演重要角色，研究者指出，被两种名为CTCF和RAD21转录因子定义的标记可以在基因的3’端进行结合，尽管在结构上表现不同，但特殊标记可以使得基因更有可能发生重组。

　　上述研究结果在很大程度上同2013年斯克利普斯研究所科学家Ann Feeney进行的研究相似，Ann Feeney的研究同样也在V基因的使用中提及了转录因子CTCF和RAD21，然而研究者最终并没有鉴别出一种简单的表观遗传学标记。Feeney说道，目前没有一个参数可以表明直接的线性关联，这并不是说如果我们有特殊的组蛋白标记，我们就可以获得较多的重排组合。

　　研究者Corcoran说道，VDJ-Seq技术仅仅是所谓的整套测序（repertoire sequencing）策略中的一种，但其却提供了两种关键的优势，第一，VDJ-Seq不像其它方法，其可以对DNA测序而并不是RNA，尽管重组通常发生于DNA中，我们仍然需要实验来直接定量地观察，从而发现一系列影响，包括产生VFJ事件的V基因之间的差异，V基因增强子以及RNA的稳定性等，其它的优势就是VDJ-Seq不会在覆盖V基因的区域出现偏差，而且VDJ-Seq并不依赖一系列V基因启动子。

　　一个关于架构的问题

　　研究者Kenter从体系结构的角度解析了免疫球蛋白重链区域的奥秘，通过利用此前存在的HiC数据库数据，他们发现，免疫球蛋白重链区域（lgh）位于名为拓扑相关结构域（TAD）的隔绝的染色体附近区域，随后研究者利用高分辨率方法（5C）以及3-D荧光原位杂交（DNA FISH）揭示了lgh的拓扑相关结构域实际上包含有三种不同的亚结构域或环状结构，每一种都和近段、中间及远端的V基因家族相对应，而且每一种都将其转角区域镶嵌到了CTCF及其它的B细胞特异性转录因子的结合位点处，这些转录因子就可以“停泊”架构环状结构。

　　如今研究者想知道是否这些特殊的转录因子会影响V基因的利用（使用），他们已经将位点压缩同环状结构联系了其它，研究者Kenter解释道，我们需要理解是否这些环状结构可以帮助确定V基因的利用。对于研究者Corcoran而言，他们目前正在深入研究来确定新鉴别出的机制是否会影响人类机体的整个免疫系统。

　　最后研究者Feeney说道，免疫球蛋白基因位点就是一种动态学的结构，在每一个B细胞中，其都会发生不同的变化，而且免疫球蛋白基因位点会发生改变，否则我们机体就不会产生多样化的体系，因此我们或许并不会惊讶地发现多个因子会影响整个机体过程，而且还是在多个不同水平下影响的，我认为这只是多种驱动力组合所引发的结果。