CRISPR先驱Nature子刊揭示重要机制

　　2016年09月10日讯 CRISPR是规律成簇的间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）的缩写。CRISPR与内切酶Cas是一对好基友，细菌依靠它们组成的防御系统对抗外来侵略者。CRISPR-Cas能够在引导RNA的指引下，靶标并切割入侵者的遗传物质。2012年研究者们利用这一特点，将CRISPR系统发展成了强大的基因组编辑工具。该系统使用简单而且扩展性强，很快便成为了生物学领域最耀眼的明星。

　　在细菌的CRISPR-Cas适应性免疫系统中，Cas1-Cas2蛋白复合体会捕获30-40bp的外源DNA，将它们整合到CRISPR的间隔区，形成自己的免疫记忆。如果这种外源DNA再次入侵，细菌就能够及时将其剪切，从而保护自身安全。外源DNA整合应当是特异性很强的，不然就会损害基因组或CRISPR序列。然而令人吃惊的是，这种活动在体外显得相当混乱。

　　加州大学伯克利分校的研究团队九月五日在Nature Structural & Molecular Biology杂志上发表文章，向人们展示了CRISPR免疫对基因组完整性的保护。这篇文章的通讯作者是著名CRISPR先驱Jennifer A. Doudna。Doudna教授是CRISPR技术的共同开发者，曾因这一技术获得了“生命科学突破奖”（Breakthrough Prize），是CRISPR专利的有力竞争者。

　　研究人员发现，酿脓链球菌（S. pyogenes）II-A型Cas1-Cas2整合酶通过限制整合第二步来维持特异性。在非CRISPR位点，整合会停在位点中间，使反应能够逆转。酿脓链球菌的Cas1-Cas2对旁边的前导重复序列有很高的特异性，能够识别重复序列的回文末端。这项研究指出，DNA插入位点没有此前人们以为的那么普遍，这样可以防止CRISPR免疫适应的毒性，有助于维持基因组的完整性。

　　加州大学伯克利分校以Jennifer A Doudna为首的研究团队取得了诸多令人侧目的CRISPR研究成果。去年四月Doudna领导的研究团队在Science杂志上发表文章，为人们揭示了CRISPR-Cmr 复合体结合靶标的具体机制。他们通过冷冻电镜技术获得了天然III型Cmr复合体及其与目标RNA结合时的分子结构，获得了接近原子水平的高分辨率。

　　去年十月，Doudna及其同事在Nature杂志上发表文章指出，Cas9 的HNH核酸酶结构域构象状态直接控制了DNA切割活性。他们通过分子内荧光共振能量转移（FRET）实验，鉴定了HNH核酸酶结构域的一种激活构象。研究还证实，一个α-螺旋将HNH的构象改变传达给RuvC结构域，激活它实现DNA切割。

　　今年年初，Doudna的研究团队揭示了CRISPR-Cas9准备剪切DNA时的关键分子结构。在CRISPR-Cas系统中，Cas蛋白与小CRISPR RNA（crRNA）形成复合体，切割与RNA互补的外源DNA。R-loop是I型和 II型CRISPR-Cas的一个典型特征，基因组编辑常用的sgRNA就会和Cas9形成R-loop。为了阐明R-loop的作用，研究人员通过冷冻电镜获得了酿脓链球菌Cas9 R-loop的高分辨率结构。