Cell Res点评尹长城教授新成果：如何打开RyRs

　　2016年09月12日讯 兰尼碱受体（Ryanodine Receptors）是内质网和肌质网（Sarcoplasmic Reticulum）释放钙离子的大型离子通道，这个过程是肌肉收缩的先决条件。近期冷冻电子显微镜提供的数据帮助科学家们直接观察到了这些巨大膜蛋白的变构运动。

　　9月Cell Research杂志封面公布了北京大学基础医学院尹长城（Chang-Cheng Yin）教授和中科院生物物理研究所孙飞（Fei Sun）研究员合作的最新成果：利用冷冻电镜获得了钙离子激活的RyR1开放态结构，总体分辨率达到4.9，核心区域分辨率达到4.2，并通过比对关闭和开放状态下的区别，揭示了钙离子如何通过长程变构“激活”RyR1的机制。

　　同期Cell Research杂志也邀请了国际RyR领域结构生物学专家Filip Van Petegem发表评述文章“How to open a Ryanodine Receptor”。Van Petegem教授曾在2010年详细描述了RyR1一个热区的结构，并对突变引起受体失常，快速释放钙离子的机制进行了推测。

　　人类基因组编码三种RyRs亚型，相对分子量均超过2.2 MDa，由超过5000个氨基酸的残基单体聚合形成。RyR1是原发骨骼肌亚型，其上百种突变与肌中央轴空病（central core disease，CCD），以及恶性高热（Malignant hyperthermia，MH）病相关。RyR2主要出现在心脏中，与压力诱导的心律不齐有关。

　　由于RyRs通道庞大，因此一直被认为是冷冻电镜cryo-EM研究的理想材料。并且随着这一技术的不断进步，科学家获得了分辨率为6.1?-3.8关闭状态的三种RyR1受体，构建出了70% 的RyR1结构。

　　从整体上说，RyRs由N末端结构域，SPRY结构域，P1和P2结构域，桥接solenoid以及中央solenoid组成，通道部分则包含S1-S6跨膜段，类电压感受器，和CTD等亚结构，因此具有6次跨膜电压门控离子通道超家族的结构特点。RyR是独特之处在于大型α 螺旋多个部位构成的一个巨大胞浆帽，其中穿插了大量的球状结构域。

　　Van Petegem指出，2009年，Samso等人以10 ? 的分辨率比对了开放和关闭状态的RyR1，为北大尹教授与同期Cell Research杂志上公布的清华颜宁教授的研究奠定了基础，这两个研究组得出了相似的RyR1跨膜区域中变构结论，也提出了不同的关于胞浆帽作用的观点。

　　RyR1受胞浆Ca2+激活打开过程呈钟形曲线，先是小幅增长促进通道开放，然后大开口打开，引发抑制作用。清华大学的研究组采用的是50μM Ca2+和 10μM 的PCB95，得到了开放状态的RyR1的冷冻电镜结构，但却发现中心区域却是关闭的，之前他们又将Tween-20 换成了CHAPS y，得到了5.7 ?的开放RyR1结构。

　　北京大学的尹教授研究组采取了不同的策略，采用的是100 μM Ca2+ 和一种能进一步稳定开放状态的封闭剂钌红。这样结合之前的开放状态结构，和10mM Ca2+浓度下8.5 ?关闭状态的结构，进行多个结构的比对。

　　6次跨膜离子通道都会出现成孔结构域（pore-forming domain）中的开放变构，内螺旋S6会在保守的甘氨酸周围弯曲，引起疏水收缩点附近的孔隙变宽，这样Ca2+就能渗透进来。这些移动变化直接偶联VSL结构域和S6，内螺旋也比一般6-TM通道要长，延伸到了能与上游U-motif接触到的锌指结构。这就为RyR开放提供了两条途径：延伸S6螺旋，配合U-motif，或VSL的移动，尹教授研究组详细描述了其中的细节变化，比如选择性滤器的变宽，S4区域向lumen的移动。

　　那么这些变构运动源自哪里呢？尹教授研究组猜测是EF-hand结构域，因为之前曾有报道发现这一结构域的突变会影响Ca2 + 感应灵敏性。另外近期的研究也表明删除整个EF-hand结构域，并不会影响RyR2 的Ca2+ 释放过程，这表明EF-hand亚结构域并不是主要的Ca2+ 感应器。但尹教授研究组发现在第一个EF-hand中会出现构象变化：其螺旋之间有33度的倾斜变化。

　　Van Petegem点评道，这些新的研究是解开RyR谜题的一大飞跃，下一步还需要研究其它影响门控的配基和蛋白的复合物结构，其中最令人感兴趣的是Cav1.1，即与RyR1有重要关联的骨骼肌电压门控钙通道。