CRISPR先驱9月连发五项重磅成果

　　2016年09月26日讯 加州大学伯克利分校的生物化学家Jennifer A. Doudna教授是基因组编辑技术变革的先驱之一，她曾因这一技术获得了“生命科学突破奖”（ Breakthrough Prize），同时也是CRISPR专利的有力竞争者。Doudna带领的研究团队取得了诸多令人侧目的CRISPR研究成果，仅在2016年9月份，她带领的研究团队就先后在国际权威期刊《Molecular Cell》、《Nature Structural Biology》、《Nature Biotechnology》、《Nature Communications》和《Nature》发表五项重磅研究成果。

　　细菌利用CRISPR RNA（crRNAs）指导的监视复合体，来靶定要破坏的外源核酸。虽然大多数I型和III型CRISPR系统需要四个或更多的不同蛋白质，才能形成多亚基的监视复合体，但是，I-C型系统只使用三个蛋白质来实现crRNA成熟和双链DNA的靶标识别。2016年9月1日，Cell子刊《Molecular Cell》在线发表的一项研究中，Doudna教授带领的研究团队表明，上述每个蛋白质都发挥着多重的功能和结构作用：Cas5c切割pre-crRNAs并招募Cas7定位RNA向导，以用于经由Cas8c的DNA结合和解旋。研究人员采用冷冻电子显微镜技术，获得了Cascade/I-C 监视复合体的自由形式和DNA结合形式的重建结构，所揭示的构象变化可使得形成R环，每一条DNA链都有不同的定位。这种精简的I-C型系统解释了CRISPR通路如何可能进化出结构紧凑，保留其作为RNA引导性DNA捕获平台的全部功能。

　　在细菌的CRISPR-Cas适应性免疫系统中，Cas1-Cas2蛋白复合体可捕获30-40bp的外源DNA，将它们整合到CRISPR的间隔区，并形成自己的免疫记忆。如果这种外源DNA再次入侵，细菌就能够及时将其剪切，从而保护自身安全。外源DNA整合应当是特异性很强的，不然就会损害基因组或CRISPR序列。然而令人吃惊的是，这种活动在体外显得相当混乱。Doudna教授带领的研究团队于2016年9月5日在《Nature Structural & Molecular Biology》杂志上发表文章，向人们展示了CRISPR免疫对基因组完整性的保护。

　　9月8日，Doudna教授和北卡罗来州立大学的Rodolphe Barrangou共同撰写的题为“Applications of CRISPR technologies in research and beyond”的综述文章，发表在《Nature Biotechnology》杂志上。这篇综述文章指出，用CRISPR-Cas9的可编程DNA裂解，使得科学家能够在单细胞和整个生物体中进行有效的、位点特异性的基因组工程。CRISPR基因组编辑已经被用于各种途径，例如控制转录、改变表观基因组、进行全基因组筛选和染色体成像。CRISPR系统已经被用于缓解动物的遗传性疾病，并可能很快用于临床治疗人类眼部和血液疾病。在中国和美国已有批准两项研究，将CRISPR-Cas9用于癌症靶向治疗。除了这些生物医学应用之外，这些工具也被用于加快农作物和畜牧育种，设计新的抗生素，控制携带疾病的昆虫。这项综述回顾了CRISPR-Cas9技术当前和未来的应用，包括治疗、异种器官移植和在畜牧、农作物、食品生物以及工业微生物的用途。该文章还讨论了这种变革性技术的科学、商业、监管和伦理影响。

　　9月14日，Doudna教授和伊利诺伊大学香槟分校的Taekjip Ha教授，以共同通讯作者身份在《Nature Communications》上发表题为“Real-time observation of DNA recognition and rejection by the RNA-guided endonuclease Cas9”的研究成果。这项研究指出，Cas9引导性RNA复合物与DNA的结合特异性，对于基因组工程应用是非常重要的，然而，不匹配如何影响靶识别/排斥反应动力学，仍没有得以很好的理解。该研究小组使用单分子FRET，来探讨Cas9-RNA和DNA靶标之间的实时互动。研究人员对Cas9-RNA的结合和解离动力学，进行了系统的调查分析，作为序列不匹配的一个功能，来迅速确定同源序列是如何被迅速识别的，以及部分匹配的序列是如何被迅速排斥的。

　　近期，Doudna教授为首的研究团队，又扩大了新发现的CRISPR蛋白C2c2的作用，该蛋白靶定RNA而非DNA。C2c2一直被称为RNA引导性RNA切酶；然而，对于这种蛋白质是如何切割RNA的，还缺乏一个全面的了解。9月26日在《Nature》发表的一篇题为“Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection”的论文中，研究人员证明，C2C2并不像以前认为的只有一种、而是有两种不同的RNA切割活性，它们一起可以被用于强大的RNA检测与降解。

　　Doudna说“这项研究扩展了我们对C2c2指导RNA加工的理解，并提供了这种新型RNase的第一种应用。C2c2实质上是一位自我武装的哨兵，在检测到其靶标后可攻击所有RNA。这种活性可以被用作一个自动放大检测器，作为一种低成本的诊断法可能是有用的。”

　　这两种不同的RNA切割活性，每种都有其各自的功能。第一种负责生产使C2c2找到特定靶RNA分子的引导性RNA。第二种可一次激活一个被发现的互补RNA靶标，作为一个普通的RNA切割器，可破坏所有存在的RNA。