巨噬细胞的吞噬作用 巨噬细胞是怎样培养的

一、巨噬细胞吞噬作用

　　细胞吞噬感染的病毒、细菌或其它一些颗粒等称为异体吞噬。溶酶体的吞噬作用是指外来的有 害物质被吞入细胞后， 即形成由膜包裹的吞噬小体（phagosome）， 初级溶酶体很快同吞噬体融合形成次级溶酶体， 此时溶酶体中的底物是从细胞外摄取的，故为异噬性的溶酶体， 在异噬性的溶酶体中吞噬物被酶 水解；水解后， 那些可溶性小分子可通过溶酶体膜进入胞质溶胶， 为细胞再利用或成为废物被排出。所以溶酶体的吞噬作用可保护细胞免受细菌与病毒等的侵 染， 是细胞的防御功能所必需的。

　　多细胞的动物具有专门的吞噬细胞，即巨噬细胞（macrophages）和中性粒细胞（neutrophils）担任机体中的保护防御任务。

　　吞噬作用亦称吞食。是指细胞从周围环境摄取固体颗粒的活动。一般认为，发生这一作用的机理本质上是与摄取液体的胞饮作用同。当固体物质吸附于细胞膜上时，膜就突出或陷入，两边的细胞膜一经融合，被膜包围的固体物质就被包在细胞内。这就称为吞噬体（吞噬泡），但不久就与溶酶体合在一起成为消化泡，被包裹的固体物质由于溶酶体内的分解酶的作用而被分解，成为低分子，从而被吸收在细胞质内。在根足类等原生动物中所见到的摄食方式是吞噬作用的原始型，但同样的细胞活动也普遍分布于后生动物中，它具有多种生物学的意义。脊椎动物白血球的吞噬作用具有防卫机体和清除废物的功能。白血球（主要是嗜中性白血球）对侵入机体的细菌的吞噬作用，可与抗体的形成相比，这对细菌感染具有重要的防御作用。单核白血球和组织球等巨噬细胞也捕食寄生性原生动物、色素颗粒、组织细胞碎片和衰老变形的血球。在昆虫和两栖类的变态时，同样的吞噬作用可以帮助吸收幼体组织。溶骨细胞也属于这类吞噬细胞。另外，网状内皮系统的各种细胞也具有同样的功能，作为固着吞噬细胞起着回收衰老无用的红血球和胆汁色素的作用

　　中性粒细胞

　　中性粒细胞内的颗粒为溶酶体，内含多种水解酶，能消化其所摄取的病原体或其他异物。一般一个白细胞处理5～25个细菌后，本身也就死亡。死亡的白细胞集团和细菌分解产物构成脓液。单核细胞由骨髓生成，在血液内仅生活3～4天，即进入肝、脾、肺和淋巴等组织转变为巨噬细胞。变为巨噬细胞后，体积加大，溶酶体增多，吞噬和消化能力也增强。但其吞噬对象主要为进入细胞内的致病物，如病毒、疟原虫和细菌等。巨噬细胞还参与激活淋巴细胞的特异免疫功能。此外，它还具有识别和杀伤肿瘤细胞，清除衰老与损伤细胞的作用。

二、巨噬细胞的培养方法

　　巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P338D1、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下：

　　1、实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。

　　2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70%酒精中3～5秒。

　　3、置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。

　　4、再用70%酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。

　　5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。

　　6、小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g4℃离心10分钟，去上清，加10mlEagle培养基。

　　7、计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90%为巨噬细胞。

　　8、为获取3×105帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。

　　9、为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃，5%CO2温箱中培养。

三、巨噬细胞的分离和纯化

　　1、取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。以下过程注意无菌操作。小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。

　　2、分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。

　　3、分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。使肺组织通过00目的钢丝网，分离单细胞。

　　4、以下过程均在4℃中进行。分别处移动图片理肺泡巨噬细胞和肺组织中的巨噬细胞：离心200×g10分钟，去上清液。轻弹试管，悬浮细胞，加入10ml低渗液（20mmol/LTris,0.75%氯化铵，pH7.4），37℃处理3～5分钟，溶解红细胞。红细胞通常分别占肺泡巨噬细胞和组织巨噬细胞的1%和10%。也可以不用低渗处理，直接在淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞。

　　5、离心200×g10分钟，去上清液。用RPMI-1640培养液洗涤细胞一次。将细胞悬液加在淋巴细胞分离液（比重1.077）上，离心400×g20分钟，收集交界面的巨噬细胞。弃去沉淀的死细胞和红细胞。

　　6、用RPMI-1640培养液洗涤巨噬细胞2次。台盼蓝染色检测细胞活力和细胞数，将细胞配成所需浓度。此时巨噬细胞活力可达90%以上，巨噬细胞占全部细胞的90%以上。

四、巨噬细胞的分子机制

　　巨噬细胞（Macrophages）能够吞没、破坏受损伤组织，有助于启动康复过程。虽然它们在损伤位点发挥关键作用，但一旦任务完成，就需要尽快撤离，结束炎症反应，为再生过程开路。继续存在的巨噬细胞不利于组织恢复。

　　尽管研究人员对于启动巨噬细胞的分子机制研究的比较透彻，但关于其退出损伤位点的过程还了解甚少。研究人员鉴别出一清除外周神经损伤位点巨噬细胞的关键环节，对弄清脊髓损伤、中风和多发性硬化中相似的分子机制提供了重要线索。已知Nogo细胞受体家族与神经细胞生长有关，SamuelDavid等观测Nogo家族成员NgR1的作用。NgR1类受体是位于细胞膜上的蛋白开关，受到特异化学信号或配体刺激后，诱导细胞反应。

　　破坏大鼠、小鼠的大腿坐骨神经，观察NgR1在修复过程中的作用，结果发现巨噬细胞到达损伤位点后，细胞表面会表达NgR1。进一步研究发现，受损神经合成髓磷脂时，NgR1不仅阻止巨噬细胞与髓磷脂结合，而且直接排斥正在形成过程中的髓磷脂，若抑制髓磷脂再生，巨噬细胞会停留在损伤位点周围。最终，研究人员在髓磷脂上鉴别出特异激发排斥反应的分子。可应用于外周神经以外的神经（中枢神经），他们发现中风、多发性硬化和脊髓损伤过程中激活的巨噬细胞，表面都会表达NgR1。

　　巨噬细胞分型

　　巨噬细胞作为一种具有可塑性和多能性的细胞群体，在体内外不同的微环境影响下，表现出明显的功能差异。目前根据活化状态和发挥功能的不同，巨噬细胞主要可分为M1型即经典活化的巨噬细胞（classicallyactivatedmacrophage），和M2型即替代性活化的巨噬细胞（alternativelyactivatedmacrophage）。

　　巨噬细胞是一种极具异质性的细胞群体，在体内复杂的微环境中，表现出独特的表型和功能 。Mantovani等 认为巨噬细胞存在一系 列连续的功能状态，而M1型和M2型巨噬细胞是 这一连续状态两个极端。M1型巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子和趋化因子，并专职提呈抗原，参与正向免疫应答，发挥免疫监视的功能；M2型巨噬细胞仅有较弱抗原提呈能力，并通过分泌抑制性细胞因子IL-10和/或TGF-B等下调免疫应答，在免疫调节中发挥重要作用。通过表型鉴定巨噬细胞的类型，在研究巨噬细胞在不同生理和病理条件下所发挥的功能具有重要的意义。然而，至今仍没有公认的表型标志来鉴定和区分不同类型的巨噬细胞，M1型和M2型巨噬细胞的表型特征尚无定论。