专访上海巴斯德研究所张岩博士—如何降低crispr/cas9脱靶率

基因编辑能够帮助人类实现"编辑"基因，完成特定dna片段的敲出、加入等，而近年来风光无限的crispr/cas9技术更是能将是具有其它基因编辑技术无可比拟的优势，能在不同物种中实现最有效、最便捷的基因删除或插入。

但是随着这一系统越来越受欢迎，关于其特异性和有效性的质疑也越来越多。在特异性上，一方面可能把无意义的片段带入靶向的基因组中，另一方面靶向编辑的效率太低，在靶向的位点上可能出现错误。在有效性上，脱靶经常出现，对脱靶的控制、处理成为重要问题。

本次记者有幸采访到了中科院张岩博士。张岩博士2010年获得中科院百人计划入选资格，目前担任中国科学院上海巴斯德研究所造血干细胞与转基因动物研究组组长，是正高级工程师。张岩博士也将出席8月12日-14日，由生物谷主办的基因编辑培训。张岩博士将与我们分享基因编辑技术中如何提高导向rna（grna）的特异性、如何降低脱靶率，提高编辑效率及如何敲除大片段的基因等精彩内容。

您认为利用crispr/cas9技术进行转基因实验时，最大的挑战是哪一步？

回答：crispr/cas9技术在细胞系或小鼠定点基因操作方面有较多应用。目前，利用crispr/cas9引入indel 突变，对细胞系或小鼠进行基因敲除效率非常高；而利用crispr/cas9技术进行基因定点敲入，尤其是大片段dna的基因定点敲入，效率还是不太高，应该是比较大的挑战。

crispr/cas9技术在实际操作中，往往会产生一些脱靶的问题，在实验过程中，我们可以通过哪些措施尽量避免？

回答：尽量sgrna专业设计的网站进行sgrna的设计。可以对可能的脱靶位点进行测序验证，以排除脱靶的可能。另外，利用cas9（d10a）nickase以及两条sgrna

在实验操作中，对打靶敲除和敲入的大片段，如何设计能提高打靶效率？

回答：无论是细胞还是小鼠，利用crispr进行基因敲除的效率非常高，而在进行大片段dna基因敲入效率较低。大片段dna基因敲入的过程是个同源重组的过程，需要使用打靶载体，打靶载体同源臂需要足够长（我们自己实验室的经验是上下游的同源臂至少各1kb）。另外，如果是在细胞中进行基因敲入，打靶载体上最好有抗性基因，能够显着增加打靶的效率。在小鼠中进行大片段的基因敲入，我们目前还是先在小鼠es细胞中进行定点基因敲入，然后通过显微注射获得嵌合鼠，最后获得大片段基因敲入小鼠。

最近韩春雨的ngago技术很火热，您认为这一技术和crispr/cas9技术相比，区别有哪些？

回答：ngago系统还需要其他实验室的重复实验验证，将来会有一个比较清晰的结论。crispr技术所使用的sgrna，可以用u6启动子在细胞内进行转录，这在未来的临床实践中比较方便；ngago使用的5'-磷酸化的单链gdna，目前还无法在细胞内合成，只能依靠体外合成然后转到细胞内，因此未来在临床实践中的使用受到限制。但在实验室使用阶段，可以将5'-磷酸化的单链gdna通过转染到细胞中，或通过显微操作注射到小鼠受精卵中，使用还是比较方便。

您带领的造血干细胞与转基因动物研究组，最近取得了哪些新的进展？

回答：利用crispr技术，可以实现对参与造血干细胞"自我更新"与造血重建调节的候选基因，进行快速、高通量的筛选。我们最近利用crispr技术结合高通量测序技术，对我们感兴趣的一百余种表观遗传调控因子进行体内功能筛选。其中，我们用到的小鼠，是mit zhang feng实验室构建的rosa26-lsl-cas9-egfp工具小鼠。由于cas9酶已经被敲入到小鼠基因组中并在骨髓细胞中表达，因此只要将含有sgrna的慢病毒感染骨髓细胞，然后进行骨髓移植即可。这种策略，大大加速了我们对造血干细胞功能研究的进度。相信这种策略，稍加改进，也可以用在其他的研究领域。